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Dottoranda Stefania Luppi

XXXIII Ciclo del Dottorato di Ricerca in Medicina materno-infantile, Pediatria dello Sviluppo e dell’Educazione, Perinatologia. STUDIO dei FENOMENI APOPTOTICI negli SPERMATOZOI e CORRELAZIONE con i PROCESSI di CAPACITAZIONE e FAGOCITOSI. Relazione I anno. Dottoranda Stefania Luppi.

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Presentation Transcript

  1. XXXIII Ciclo del Dottorato di Ricerca in Medicina materno-infantile, Pediatria dello Sviluppo e dell’Educazione, Perinatologia STUDIO dei FENOMENI APOPTOTICI negli SPERMATOZOI e CORRELAZIONE con i PROCESSI di CAPACITAZIONE e FAGOCITOSI Relazione I anno DottorandaStefania Luppi 29 Settembre 2008

  2. Fagocitosi corpi apoptotici SENZA infiammazione Rottura equilibrio = DIFETTIMATURAZIONE APOPTOSI Morte cellulare programmata Ruolo essenziale nel CONTROLLO NUMERO CELLULE GERMINALI Lee et al. 1997 Spermatogenesi: PERDITA di circa il 75% del pot. numero di spz maturi Dunkel et al.1997 FERTILITA’??

  3. SERTOLI FasL Fas DD GERM CELL • M con parametri liquido seminale anormale: % spz Fas+ Il SISTEMA Fas/FasL Sakkas et al., 1999, 2002 • Individuata via di segnalazione Fas in spz EIACULATI “APOPTOSI ABORTIVA” In alcuni casi di INFERTILITA’ compromissione di mecc. apoptotici durante spermatogenesi, percui Spz Fas+ NON vengono eliminati.

  4. Soggetti normo- e non normo-zoospermici Fas presente su membrana LEUCOCITI Dati i risultati contrastanti presenti in letteratura è da chiarire la presenza o meno di Fas su spz eiaculati

  5. Traslocazione Fosfatidil-Serina (PS) Perdita asimmetria PL di membrana Legame AnnessinaV fluo (AV) - PS FACS RIDUZIONE dell’INTEGRITA’ di MEMBRANA Molto frequente in SOGGETTI INFERTILI Ricci et al.,2002; Glander et al.,1999 Evento PRECOCE di apoptosi • Spermatozoi: • vitali (AV-/PI-) • apoptotici (AV+/PI-) • necrotici (AV+/PI+) ec + PI ic

  6. FACS Syto-16 / 7-AAD(7-Amino-Actinomycin-D) lega DNA cell vive/apoptotiche penetra in cell necrotiche • Spermatozoi: • vitali (Syto-16++) • apoptotici (Syto-16+) • necrotici (Syto-16-/7-AAD+) Perticarari et al., 2007

  7. Potenziale enorme di interazioni tra leucociti e sist.riproduttivo • Ruolo leucociti nel liquido seminale non ancora spiegato • Correlazione LEUCOCITI e INDICE APOPTOTICO spz spz Ricci et al., 2002 in soggetti normo- e NONnormo-zoospermici • [ ] leuco: • monociti • linfociti • PMN FACS moAb anti-CD45 LEUCOCITI e APOPTOSI Funzione cellulare fisiologica dei leucociti, in assenza di infez., responsabili di RIMOZIONE SPZ APOPTOTICI migliorando la qualità del seme.

  8. a. In mammiferi dopo INSEMINAZIONE una grande q di spz viene rimossa attraverso FAGOCITOSI da parte delle cellule del tratto genitale Suarez et al., 2002; Pandya e Cohen, 1985 b. FECONDAZIONE avviene SOLO in seguito a CAPACITAZIONE degli spz nel tratto genitale dopo richiamo LEUCOCITI per chemotassi, In app genitale inducono APOPTOSI spz post-capacitati che NON hanno fertilizzato l’ovocita, a cui segue la FAGOCITOSI senza reaz infiammatoria. FAGOCITOSI degli SPZ APOPTOTICI

  9. Definire il ruolo dei LEUCOCITI in rapporto all’apoptosi e alla rimozione degli spermatozoi Metodica: moAb fluoresceinati anti-CD45 in FACS OBIETTIVI della RICERCA: Studio dell’APOPTOSIdegli spz, in condiz. fisiologiche e dopo capacitazione in vitro: - diversi marker dell’apoptosi - in pz normo- e NONnormo-zoospermici Metodiche: AV/PI; Syto-16/7-AAD in FACS Analisi del SISTEMA Fas/FasL negli spz, in condiz. basali e dopo capacitazione in vitro e nei leucociti Metodiche: moAb fluoresceinati anti-Fas in combinazione con il FACS moAb fluoresceinti anti-CD45

  10. ….. Confermare il risultato di altri studi in cui si è dimostrato che, se indice apoptotico spz è > 40%, si riscontra < prob di gravidanza e > prob di aborti spontanei in seguito a tecniche di PMA (IUI, FIVET) 5. Analisi del processo di FAGOCITOSI degli spz in condizioni basali e dopo capacitazione in vitro in pz normo- e NONnormo-zoospermici: - anomalie nella fagocitosi in casi di INFERTILITA’ di COPPIA - > suscettibilità di spz di maschi infertili ad essere fagocitati Tali informazioni fornirebbero una possibilità in più per la diagnostica delle infertilità e una possibile chiave di intervento per il loro trattamento.

  11. Phrodo succinimydil ester Risultati confermati con MICROSCOPIA OTTICA A FLUORESCENZA 2) Suscettibilità spz ad essere fagocitati PRIMA e DOPO CAPACITAZIONE in vitro Fagocitosi può favorire RIMOZIONE spz meno efficienti Spz non colorati Spz non cap pHrodo Spz cap pHrodo RISULTATI PRELIMINARI Allestito test citometrico per verificare CAPACITA’ di FAGOCITOSI degli spz da parte di MACROFAGI (FACS)

  12. NON CAP CAP (mp) 3) Differenza dovuta a ≠ espressione di molecole di spf come C1q (macrofagi) e C1qR (spz) NON CAP: moAb anti-C1qR clone 74, clone 60 CAP: moAb anti-C1qR clone 74, clone 60 AMPLIARE CASISTICA per verificare se questa differenza è correlata a ≠ fagocitosi da parte dei macrofagi e comprendere se e come le 2 tecniche di capacitazione in vitro (MP e SU) possano influire su tale meccanismo.

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