1 / 15

A Tokuyasu módszer és alkalmazása P2 receptorok vizsgálatában

A Tokuyasu módszer és alkalmazása P2 receptorok vizsgálatában. NTPD ázok: e k tonu k leotid ázok, melyek az extracelluláris nukleotidok gamma és b é ta foszfátját különböző sebességgel hidrolizálják aktivitásuk befolyásolja a P2 receptorok általi jelátvitelt

vesta
Download Presentation

A Tokuyasu módszer és alkalmazása P2 receptorok vizsgálatában

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. A Tokuyasu módszer és alkalmazása P2 receptorok vizsgálatában

  2. NTPDázok:ektonukleotidázok, melyek az extracelluláris nukleotidok gamma és béta foszfátját különböző sebességgel hidrolizálják aktivitásuk befolyásolja a P2 receptorok általi jelátvitelt jelentős szerepük a vaszkulatúrában Az NTPDázoknemcsak terminálják (P2Y2) vagy aktiválják a P2 (P2Y1, P2Y3, P2Y12 és P2Y6) a különböző P2 receptorokat és aktiválják az adenozin receptorokat is

  3. NTPDase1 (CD39, 78 kd) megakadályozza az ADP- kiváltotta vérlemezke összecsapzódást Jellemző:endothel, endocardium és simaizom/szívizom sejtekben posztranszlációs módosulás után a kaveolákban dúsul fel Fő ektonukleotidáz a vaszkuláris és trofoblaszt szövetekben.

  4. Kaveola glikoszfingolipidek + hosszú, egyenes zsírsavláncú lipidek normál lipidek kaveolin GPI kapcsolt enzimek és receptorok palmitilált SCR kinázok kaveolához kötődő,jelátvitelben szereplőtranszmembrán receptorok

  5. Van-e kolokalizáció a P2Y1 és/vagy P2Y2 receptorokkal egy olyan szövetben, ahol az NTPDáz1 bizonyítottan az elsődleges ektonukleotidáz?

  6. P2Y1 P2Y2 Humán placenta

  7. CD39- syncytiotrophoblast CD39-cytotrophoblast

  8. CD39- P2Y1 Szövet: humán placenta, endothelsejt

  9. P2Y1- EC

  10. Tokuyasu eljárás (1980) – ultrakriosztátos metszeteken végzett immunreakció Előnyei:gyors (fixálástól EM vizsgálatig 1 nap elég lehet) a szöveteket elég PA-del fixálni intracelluláris antigének könnyebb kimutatása többszörös immunarany jelölés lehetősége Hátrány: ultrakriosztát kell (feltét az ultramikrotómhoz) folyékony nitrogén kell (sok) kés (lehet üveg vagy gyémánt, de metszeni tudni kell) szöveti kép „más” (az új módszer jelentősen javítja a minőséget) kis blokkméret

  11. Általános eljárás: Perfúziós vagy immerziós fixálás majd a fixáló kimosása ~ 2 mm3 térfogatú szöveti blokk kivágása Cseppben (3X) végzett krioprotekció (2.1 M szaccharóz /PBS / 0.2 M glicin) 15-30 perc Metszés : -120 ° C-on (gyémántkés) vagy -90 ° C (üvegkés) metszetek felvétele: 1:1 2.3 M szaccharóz -2 % metilcellulóz cseppel ráhelyezni szenezett, formvarhártyás rácsra Az immunreakció cseppeken történik, a metszeteket sosem szabad kiszáradni hagyni. Az eljárás megeygezik a szokványos immunnal (blokkolás, inkubálások, mosások - idő mindössze kb 2 óra) utófixálás: 1% GA Kontrasztozás: 9 rész 2% metilcellulóz : 1 rész 3 % uranilacetát 5 °C

  12. Toshihiro Takizawa,Clark L. Anderson, and John M. Robinson A New Method to Enhance Contrast of Ultrathin Cryosectionsfor Immunoelectron Microscopy The Journal of Histochemistry & Cytochemistry Volume 51(1): 31–39, 2003 http://www.jhc.org Humán placenta

  13. A módosítás előnye:nagyobb kontraszt, szebb szöveti kép (ittpozítív festés, a klassszikus eljárásnál negatív festés van) Eljárás 2 óra 4 % PA - kakodilát puffer, mosás, beágyazás 10% zselatinba (kakodilát pufferben)ezt vágják pici blokkokra és itatják át szaccharózzal (kakodilát puffer). Metszés. A metszeteket 0.75% zselatin–2.0 M szaccharózvagy(1% metilcellulóz –1.15 M szaccharóz cseppekkel viszik és 0.25% polilizines üveg fedőlemezekre vagy formvarhártyás, szenezett EM rácsokra. Amennyiben az oldatban 0.05% Na-azid is van, 4°C-on tárolható az immunfestésig

  14. Utófixálás:1–2% ozmium tetroxide 0.1 M kakodilátpufferben, pH 7.4, 15 perc, RT , mosás Beágyazás :apolivinil alkohol (PVA)-technika módosított változata : 0.8% UA–1.6% PVA , 15 perc, gyors PVA mosás Kontrasztfestés:0.0015% ólomcitrát - 2% PVA 15 perc RT A felesleg leitatása, szárítás... Másik lehetőség : utófixálás 2% ozmium tetroxide–1.6% K-ferrocianid / 0.1 M kakodilát puffer, pH 7.4, 15 prec

  15. utófixálás : 2% ozmium tetroxid–1.6% K-ferrocianiddal Humán placenta (JHC, 51(1): 31–39, 2003)

More Related