170 likes | 419 Views
Kwasy nukleinowe jako leki. Cz. II – nośniki terapeutycznego DNA. Technologie transferu genów w somatycznej terapii genowej. Wektory adenowirusowe. Dwuniciowe DNA, ok.36 kpz. geny kodujące białka regulatorowe indukujące replikację wirusa; geny kodujące białka kapsydu; kapsyd.
E N D
Kwasy nukleinowe jako leki Cz. II – nośniki terapeutycznego DNA
Wektory adenowirusowe • Dwuniciowe DNA, ok.36 kpz. • geny kodujące białka regulatorowe indukujące replikację wirusa; • geny kodujące białka kapsydu; • kapsyd • wektor I generacji - delecja w regionie kodującym białko niezbędne do replikacji; • wektor II generacji - delecja w regionie kodującym białka ulegające ekspresji przed replikacją; • wektor III generacji - najmniej immunogenne, ponieważ nie zawierają praktycznie żadnych sekwencji wirusowych. nie następuje integracja chromosomalna (łatwość eliminacji, ale brak niebezpieczeństwa mutagenezy insercyjnej); można transfekować komórki nieproliferujące (np. neurony lub hepatocyty), także in vivo.
Wektory retrowirusowe • Genom - jednoniciowy RNA; • cykl życiowy jest stosunkowo złożony; • lipidowa otoczka; • rozpoznają swoiste • receptory na • powierzchni • infekowanych • komórek;
Wektory retrowirusowe • Geny wirusowe zastąpione genami terapeutycznymi – wirus nie ulega dalszej replikacji w komórkach docelowych; • po wniknięciu, RNA jest przepisywane na DNA • i odwrotny transkrypt jest wbudowywany w genom gospodarza w trakcie mitozy; • transgen do 10 kpz • duża wydajność transfekcji • długotrwała ekspresja transgenu; • ryzyko wystąpienia mutacji insercyjnych i aktywacji onkogenów; • wprowadzanie do komórek dzielących się; głównie ex vivo.
Wektory lentiwirusowe • Należą do rodziny retrowirusów; • najczęściej stosowany wektor na bazie wirusa HIV-1; • usuwa się materiał • odpowiedzialny • za właściwości • patogenne;
Wektory lentiwirusowe • Zdolność do infekowania limfocytów; • aktywnie transportowane do jądra komórkowego przez pory jądrowe; • możliwość stosowania w komórkach • nie dzielących się; • dodanie glikoproteiny G z wirusa VSV daje możliwość wprowadzania zrekombinowanych wirusów do innych typów komórek, w sposób in vivo.
Wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV) • Należą do parwowirusów; nie są patogenne • genom AAV - jednoniciowy DNA liczący ok. 5 kpz.; • Potrzebna koinfekcja wirusem pomocniczym – adenowirusem lub wirusem opryszczki; • gen rep - integracja latencyjna DNA wirusa z sekwencjami znajdującymi się na dłuższym ramieniu 19 chromosomu - nie indukują odpowiedzi immunologicznej; ekspresja trwa bardzo długo; - łączą zalety wektorów retrowirusowych – zdolność do integracji z genomem komórki i wektorów adenowirusowych – transdukcja komórek nie dzielących się.
Wirus opryszczki typu pierwszego HSV-1 • Dwuniciowy DNA, duży genom - (152 kpz), zawierający 84 geny, replikacja zachodzi nawet • po usunięciu połowy z nich; • możliwość wprowadzenia bardzo długich transgenów w różne miejsca wektora; • nie integruje się do genomu; • infekuje szeroki • zakres komórek; • neurotropizm.
Wirus opryszczki typu pierwszego HSV-1 • Defektywne mutanty z delecją w genach odpowiedzialnych za występowanie cyklu litycznego. Wektory takie nie są cytotoksyczne • i są zdolne do przechodzenia w stan podobny • do latencji w neuronach i innych tkankach; • Wektory warunkowo replikujące się, z delecją kilku genów - zakażają wybrane komórki.
Hybrydowe wektory wirusowe • Kombinacja adenowirusów z wektorami AAV - genom AAV zamykany w kapsydzie adenowirusa. Uzyskuje się zdolność do integracji z genomem komórki docelowej w określonym miejscu, dzięki genowi rep. • Wektory łączące elementy adenowirusów • i retrowirusów – w kapsydzie adenowirusa • z materiałem retrowirusa. Otrzymuje się dużą wydajność transdukcji i zdolność integracji • z genomem komórki docelowej.
Idealny wektor wirusowy • Łatwość wyprodukowania w dużych ilościach, • a także zachowanie trwałości podczas transportu i przechowywania; • utrzymywanie ekspresji transgenu na stałym poziomie lub precyzyjna regulacja; • brak odpowiedzi immunologicznej; • duża pojemność wprowadzania genów; • integracja z genomem w ściśle określonym miejscu; • zdolność wprowadzania materiału genetycznego do szerokiego zakresu komórek dzielących się • i nie dzielących się.
Nośniki niewirusowe • Składają się z syntetycznych związków chemicznych lub wysoko oczyszczonych substancji pochodzenia naturalnego; • nie ma tu ryzyka aktywacji onkogenów; • mniejsza wydajność transferu związana z ujemnym ładunkiem plazmidowego DNA i jego wielkością – potrzebna kondensacja w cząsteczkach nośnika.
Terapia genowa Przykłady eksperymentalnych terapii wykazujących wysoką skuteczność • wprowadzanie genu kodującego czynnik wzrostowy VEGF-2 lub FGF-2 bezpośrednio • do komórek mięśnia sercowego pacjentów z zawansowaną niestabilną chorobą • wieńcową. Efekt – indukcja neoangiogenezy. • zastosowanie wirusa Onyx-015 jako pomocniczego czynnika terapeutycznego • u pacjentów z rakiem krtani. Wirus selektywnie rozpoznaje i niszczy komórki • ze zmutowanym białkiem p53 (45 – 70% w komórkach raka krtani). • zastosowanie adenowirusów przenoszących gen TIMP-3 (koduje Tkankowy Inhiibitor • Metaloproteinazy-3), dla zapobiegania nawrotom arteriosklerozy u pacjentów • po zabiegach angioplastyki. • zastosowanie rekombinowanych genów kodujących czynniki krzepliwości VIII lub IX • w AAV jako nośniku, dla leczenia hemofilii. Gen kodujący czynnik VIII w wersji • skróconej.