1 / 63

Klinikai genomika 2013.

Klinikai genomika 2013. A genetikai módszerek alapjai: DNS-RNS szerkezet. Alapja a nukleinsav láncok kettős lánc kialakításának képessége ( komplementer szálak hibridizációja) DNS-DNS, DNS-RNS, RNS-RNS kapcsolat. tompa vég. ragadós vég. Restrikciós enzimek.

vine
Download Presentation

Klinikai genomika 2013.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Klinikai genomika2013.

  2. A genetikai módszerek alapjai: DNS-RNS szerkezet • Alapja a nukleinsav láncok kettős lánc kialakításának képessége (komplementer szálak hibridizációja) • DNS-DNS, DNS-RNS, RNS-RNS kapcsolat

  3. tompa vég ragadós vég Restrikciós enzimek • Restrikciós enzimek lehetővé teszik a DNS feldarabolását

  4. RFLP

  5. SNP-RFLP;Southern blot • Single nucleotid polymorphism (SNP) egy bázisnyi polimorfizmus

  6. A témában a genetikai, majd genomikai kutatások száma 1990 után ugrott meg. PCR készülék Kary Mullis Nobel díj 1993 PCR, 1986

  7. Real time-PCR • Valós idejű PCR- amplifikáció előrehaladtával arányosan erősödő fluoreszcencia – kvantitatív meghatározást tesz lehetővé

  8. PCR-RFLP • A vizsgált DNS szakaszt PCR-rel felamplifikáljuk • A keletkezett terméket hasítjuk restrikciós enzimekkel Állapítsa meg az 1-5 személyek vércsoportját!

  9. VNTR-marker • VNTR-variable-number tandem repeats, kódoló, vagy nem-kódoló régióban is lehet • A DNS mindenkiben előforduló két fix poziciója között egyedenként eltérő számú bázispár található • VNTR-ek egyedi mintázatot mutatnak-DNS fingerprint • VNTR lehet miniszatellit- 10-60bp, mikroszatellit- 1-4bp, mikroszatellit a STR-short tandem repeat, és az SSR-single sequence repeat www.scq.ubc.ca VNTR-RFLP

  10. VNTR vizsgálatKvantitatív fluoreszcens multiplex PCR • A vizsgálat az STR/VNTR lókuszok hosszúságpolimorfizmusán alapszik • Multiplex PCR-rel vizsgálják • A PCR termékeket kapilláris elektroforézissel választják el.

  11. Kapilláris (gél)elektroforézis • A kapilláris gélelektroforézis a hagyományos gél-lap elektroforézis kapilláris elektroforézis megfelelője. • Főbb előnye, hogy sokféle gél-mátrix használható – más az elválasztás (RNS, DNS, protein) 18S RNS 28S RNS 18S RNS 28S RNS létra Hibás futás

  12. VNTR klinikai felhasználás • Triplet repeat diseases (TRD) olyan betegségek, ahol a mutáns génben 3 bázisból álló DNS tripletek (pl. CCG) tandem ismétlődnek akár több százszor (pl. CCG CCG CCG CCG CCG). • A vad típusú allél csak néhány triplet ismétlődést tartalmaz, míg a TRD mutánsban a repeat-ek száma felsokszorozódik és az így kialakuló mutáns gén nagy számú tandem triplet repeat-et tartalmaz • pl. Huntington kór, < 28 normál tartomány; páciensben nem fejlődik ki a kór 29-34 páciensben nem fejlődik ki kór, de a következő generáció veszélyeztetett 35-39 néhány egyénben kifejlődik a betegség, de nem mindenkiben, a következő generáció is veszélyeztetett > 40 kifejlődik a Huntington kór • További TRD betegségek: FragilisX (FMR1), spinobulbar muscular atrophy, Friedreich’s ataxia, spinocerebellar ataxia

  13. Igazságügyi teszt • DNS profil= az összes vizsgált kromoszóma marker genotípusa az adott egyedben • Törvényszéki tesztek ált. 11-13 kromoszóma markert vizsgálnak • Nem meghatározás: amelogenin polimorfizmus- amelogenin gén mind az X, mind az Y kromoszómán megtalálható, de az Y kromoszóma tartalmaz 6 olyan bázispárt, amit az X nem, ez alapján meghatározható a nem

  14. Prenatális diagnosztika; fekete: 21 (és nemi); zöld: 13; kék: 18-as kromoszóma; ha 2 marker látszik minegyikből: nincsenek ilyen kromoszóma rendellenességei (99%) Méret marker (piros) 2 marker a nemi kromoszómákra: fiú

  15. 3 db 21-es marker: 21-es triszómia Egy nemi marker: lány

  16. Triploidia 18 13 21

  17. A hólyagtumorok korai kimutatása FDA Cleared

  18. Hólyagtumorok jelentősége • USA: 57.000 új beteg (2003), 10.000 halál • Kb. 600.000 beteg/USA • 400.000 betegnek van magas kockázata, hogy a betegség kiújuljon. • Magyarország: 3-szor annyi férfi hal meg, mint nő • Európában a rosszindulatú tumorok között az ötödik, USA-ban a negyedik leggyakoribb. • Gyakorisága növekszik: becslések szerint 2010-re 28%-kal lesz magasabb az előfordulása

  19. Kondas J, Szentgyorgyi E. Transurethral resection of 1250 bladder tumours Int Urol Nephrol. 1992;24(1):35-42. • Magyarország: • 1250 resectio után a recidiva aránya: • 1 éven belül 23,8% • 3 éven belül 36,6% • 5 éves túlélési idő 66,5%

  20. A hólyagrák diagnosztikájában jelenleg elterjedt és elérhető eszközök: Cystoscopia • 0-2 évig: 3 havonta • 2-4 évig: 6 havonta • 5 év felett: évente Cytologia • a cystoscopiákkal egyidőben

  21. A fluorescens in situ hybridizációs DNS teszt (FISH) alapjai • Rövid DNS szakaszt (oligonukleotidot) fluorescens festékkel jelölnek. • Ez az oligonukleotid komplementer a minta (a vizsgált) DNS (kromoszóma) egy szakaszához

  22. Hibridizálás A denaturált (egyszállúsított) mintával összehozva a jelölt oligonukleotid felismeri a komplementer szakaszt és odaköt (hibridizál).

  23. A fluorescens in situ hybridizációs DNS teszt (FISH)

  24. Előkészítés >33 ml 73ºC

  25. UroVysion próbák  LSI 9p21 Spectrum Gold  CEP 3 Spectrum Red  CEP 7 Spectrum Green  CEP 17 Spectrum Aqua 3-askromoszóma 7-es kromoszóma 9-es kromoszóma 17-es kromoszóma 93 hólyagrákos és 86 normál betegen ellenőrizték a módszert

  26. Normális és abnormális sejtmag összehasonlítása az optimalizált próbaszettel Abnormális Normális

  27. UroVysion: Példák a lehetséges eltérésekre Normál Aneuploid Aneuploid

  28. Szekvenálás

  29. Szekvenálás sebessége • 1990-2003: 1. humán genom • 2007: 2 hónap/1 humán genom: Roche (454 Life Sciences); • 2010: 7 nap Illumina; • 2013: 1 nap;

  30. 2008 január: 2007 év módszere: szekvenálás

  31. Humán genom szekvenálásának ára • Hagyományos (Sanger) módszer • HGP összköltsége: 3 milliárd $ • 2001-ben átlagosan 10$/bázis: • 2003: 300 millió $/ humán genom • Új generációs szekvenálás: • 2010: 7 nap Illumina; 10 ezer $ • 2013: 1,000 $ Complete Genomics

  32. Ion Proton: 149,000 $

  33. NGS • Exom-szekvenálás • Célzott szekvenálás • Bioinformatika

  34. Microarray technológia • Nukleotid láncok hibridizálásán alapuló nagy felbontású technológia • Nukleotid próbákat kötnek szilárd hordozóra, ami lehet üveglapka-chip, illetve gyöngy Jelölt mintát hibridizálnak a próbákhoz • Jel intenzitást mérnek

  35. Comparative genome hybridization = CGH • ArrayCGH = aCGH- genomiális DNS összehasonlítása microarray hibridizációval • Hátrány: VOUS- variants of uncertain clinical significance Kiegyensúlyozott transzlokációk és alacsony szintű mozaicizmus nem vizsgálható

  36. aCGH

  37. aCGH klinikai felhasználása • Betegség fókuszált array-k • Hematológiai, onkológiai array-k • Prenatális array-k • Preimplantációs array-k

  38. Már megszületett az első újszülött, akinek anyja korábban habituális vetélő volt, de a aCGH-val sikerült kiválasztani IVF-nél a megfelelő ivarsejteket. • aCGH a fejlődési rendellenességek 12%-át tudta kimutatni, a hagyományos kariotipizálás 2%-át. 200$ többletköltség/beteg. • VRONY= veleszületett Rendellenességek Országos nyílvántartása

  39. Expressziós microarray • mRNS expressziós szintek összehasonlítására alkalmas a vizsgált mintákban/csoportokban • Komplex bioinformatikai elemzés jellemző (GSEA-gene set enrichment analízis, Pathway analízis) • Felhasználás pl.mikrobiológia-gazda patogén kölcsönhatás vizsgálata, gyógyszerfejlesztés, gyógyszer hatásvizsgálat, biomarker keresés (tumor diagnosztika)

  40. Fiktív eset: Fragilis-X-szindróma • Egy 6 éves fiú ismeretlen eredetű középsúlyos értelmi fogyatékosság miatt került a gyermek-neurológiai szakrendelésre. • Egyéb tünete nem volt, azonban arca jellegzetes: • hosszúkás arc • előreugró (erőteljes) állkapocs • nagy, elálló fülek. Fénykép: http://www.ildongmom.com/servlet/service.FCntDselService?url=EmbryoSub2menu5 44 Erdélyi D

  41. A FRAXA gén(17 exont tartalmaz) Exon 3 Exon 2 Exon 1 CGG-ismétlődés DNS mRNS CpG-szigetek 5’-UTR 3’-UTR kódoló szekvencia • CGG-ismétlődés: • 5-44 (54): normális - egészséges, stabil • 45-54: szürke zóna - egészséges, instabil • 55-230: premutáció - egészséges(*), utódja beteg lehet • 230-1000: teljes mutáció - beteg vagy hordozó nő 45 Erdélyi D

  42. A fragilis-X-szindróma diagnosztikája Citogenetikai vizsgálat: folsav-hiányos tenyésztőfolyadék alkalmazásával megjelenő „töréspont” (ma már nem használják) PCR alapú vizsgálat (csak szűrővizsgálatként) Southern-blot alapú vizsgálat (jelenleg ezt tartjuk legalkalmasabbnak) 46 Erdélyi D

  43. Citogenetikai vizsgálat • Hátránya: • nagyon munkaigényes, • soká ad eredményt • sok az álnegatív és álpozitív lelet p q q27.3 Forrás: www.mun.ca/biology/scarr/ Fragile_X_chromosome.htm 47 Erdélyi D

  44. PCR-diagnosztika 1 2 3 4 5 6 7 8 M 89 78 • Egészséges férfi • Egészséges nő • Egészséges nő (homozigóta) • Szürke zóna, nő • Full-mutációs férfi • Full-mutációs nő • Premutációs nő • Premutációs férfi 50 35 32 30 28 22 20 26 48 1 2 3 4 5 6 7 8 M Erdélyi D

  45. Southern-blot vizsgálat izotóppal jelzett próba Exon 1 EcoR I Eag I (metiláció-érzékeny: csak nem metilált szekvenciát hasít) EcoR I metiláció történik (a.) normálisan nőkben az egyik X-kromoszóma inaktivációjakor, vagy (b.) kóros esetben nagyon nagyszámú CGG-ismétlődés miatt 2,8 Kb 5,2 Kb 49 Erdélyi D

  46. 1: Egészséges férfi: 2,8 Kb nem-metilált fragmentum. 2: Premutációs férfi: kissé hosszabb rövid Kb fragmentum. 3,4: Full-mutációs férfiak: jelentősen hosszabb hosszú fragmentum. 5: Egészséges nő: 5,2 Kb metilált és 2,8 Kb nem-metilált fragmentum. 6: Premutációs nő: kissé hosszabb rövid és 5.2 Kb fragmentum. 7,8: Full-mutációs nők: jelentősen hosszabb hosszú fragmentum. 50 Forrás: http://www.compgene.com/fmr1.htm Erdélyi D

More Related