630 likes | 853 Views
Klinikai genomika 2013. A genetikai módszerek alapjai: DNS-RNS szerkezet. Alapja a nukleinsav láncok kettős lánc kialakításának képessége ( komplementer szálak hibridizációja) DNS-DNS, DNS-RNS, RNS-RNS kapcsolat. tompa vég. ragadós vég. Restrikciós enzimek.
E N D
A genetikai módszerek alapjai: DNS-RNS szerkezet • Alapja a nukleinsav láncok kettős lánc kialakításának képessége (komplementer szálak hibridizációja) • DNS-DNS, DNS-RNS, RNS-RNS kapcsolat
tompa vég ragadós vég Restrikciós enzimek • Restrikciós enzimek lehetővé teszik a DNS feldarabolását
SNP-RFLP;Southern blot • Single nucleotid polymorphism (SNP) egy bázisnyi polimorfizmus
A témában a genetikai, majd genomikai kutatások száma 1990 után ugrott meg. PCR készülék Kary Mullis Nobel díj 1993 PCR, 1986
Real time-PCR • Valós idejű PCR- amplifikáció előrehaladtával arányosan erősödő fluoreszcencia – kvantitatív meghatározást tesz lehetővé
PCR-RFLP • A vizsgált DNS szakaszt PCR-rel felamplifikáljuk • A keletkezett terméket hasítjuk restrikciós enzimekkel Állapítsa meg az 1-5 személyek vércsoportját!
VNTR-marker • VNTR-variable-number tandem repeats, kódoló, vagy nem-kódoló régióban is lehet • A DNS mindenkiben előforduló két fix poziciója között egyedenként eltérő számú bázispár található • VNTR-ek egyedi mintázatot mutatnak-DNS fingerprint • VNTR lehet miniszatellit- 10-60bp, mikroszatellit- 1-4bp, mikroszatellit a STR-short tandem repeat, és az SSR-single sequence repeat www.scq.ubc.ca VNTR-RFLP
VNTR vizsgálatKvantitatív fluoreszcens multiplex PCR • A vizsgálat az STR/VNTR lókuszok hosszúságpolimorfizmusán alapszik • Multiplex PCR-rel vizsgálják • A PCR termékeket kapilláris elektroforézissel választják el.
Kapilláris (gél)elektroforézis • A kapilláris gélelektroforézis a hagyományos gél-lap elektroforézis kapilláris elektroforézis megfelelője. • Főbb előnye, hogy sokféle gél-mátrix használható – más az elválasztás (RNS, DNS, protein) 18S RNS 28S RNS 18S RNS 28S RNS létra Hibás futás
VNTR klinikai felhasználás • Triplet repeat diseases (TRD) olyan betegségek, ahol a mutáns génben 3 bázisból álló DNS tripletek (pl. CCG) tandem ismétlődnek akár több százszor (pl. CCG CCG CCG CCG CCG). • A vad típusú allél csak néhány triplet ismétlődést tartalmaz, míg a TRD mutánsban a repeat-ek száma felsokszorozódik és az így kialakuló mutáns gén nagy számú tandem triplet repeat-et tartalmaz • pl. Huntington kór, < 28 normál tartomány; páciensben nem fejlődik ki a kór 29-34 páciensben nem fejlődik ki kór, de a következő generáció veszélyeztetett 35-39 néhány egyénben kifejlődik a betegség, de nem mindenkiben, a következő generáció is veszélyeztetett > 40 kifejlődik a Huntington kór • További TRD betegségek: FragilisX (FMR1), spinobulbar muscular atrophy, Friedreich’s ataxia, spinocerebellar ataxia
Igazságügyi teszt • DNS profil= az összes vizsgált kromoszóma marker genotípusa az adott egyedben • Törvényszéki tesztek ált. 11-13 kromoszóma markert vizsgálnak • Nem meghatározás: amelogenin polimorfizmus- amelogenin gén mind az X, mind az Y kromoszómán megtalálható, de az Y kromoszóma tartalmaz 6 olyan bázispárt, amit az X nem, ez alapján meghatározható a nem
Prenatális diagnosztika; fekete: 21 (és nemi); zöld: 13; kék: 18-as kromoszóma; ha 2 marker látszik minegyikből: nincsenek ilyen kromoszóma rendellenességei (99%) Méret marker (piros) 2 marker a nemi kromoszómákra: fiú
3 db 21-es marker: 21-es triszómia Egy nemi marker: lány
Triploidia 18 13 21
A hólyagtumorok korai kimutatása FDA Cleared
Hólyagtumorok jelentősége • USA: 57.000 új beteg (2003), 10.000 halál • Kb. 600.000 beteg/USA • 400.000 betegnek van magas kockázata, hogy a betegség kiújuljon. • Magyarország: 3-szor annyi férfi hal meg, mint nő • Európában a rosszindulatú tumorok között az ötödik, USA-ban a negyedik leggyakoribb. • Gyakorisága növekszik: becslések szerint 2010-re 28%-kal lesz magasabb az előfordulása
Kondas J, Szentgyorgyi E. Transurethral resection of 1250 bladder tumours Int Urol Nephrol. 1992;24(1):35-42. • Magyarország: • 1250 resectio után a recidiva aránya: • 1 éven belül 23,8% • 3 éven belül 36,6% • 5 éves túlélési idő 66,5%
A hólyagrák diagnosztikájában jelenleg elterjedt és elérhető eszközök: Cystoscopia • 0-2 évig: 3 havonta • 2-4 évig: 6 havonta • 5 év felett: évente Cytologia • a cystoscopiákkal egyidőben
A fluorescens in situ hybridizációs DNS teszt (FISH) alapjai • Rövid DNS szakaszt (oligonukleotidot) fluorescens festékkel jelölnek. • Ez az oligonukleotid komplementer a minta (a vizsgált) DNS (kromoszóma) egy szakaszához
Hibridizálás A denaturált (egyszállúsított) mintával összehozva a jelölt oligonukleotid felismeri a komplementer szakaszt és odaköt (hibridizál).
Előkészítés >33 ml 73ºC
UroVysion próbák LSI 9p21 Spectrum Gold CEP 3 Spectrum Red CEP 7 Spectrum Green CEP 17 Spectrum Aqua 3-askromoszóma 7-es kromoszóma 9-es kromoszóma 17-es kromoszóma 93 hólyagrákos és 86 normál betegen ellenőrizték a módszert
Normális és abnormális sejtmag összehasonlítása az optimalizált próbaszettel Abnormális Normális
UroVysion: Példák a lehetséges eltérésekre Normál Aneuploid Aneuploid
Szekvenálás sebessége • 1990-2003: 1. humán genom • 2007: 2 hónap/1 humán genom: Roche (454 Life Sciences); • 2010: 7 nap Illumina; • 2013: 1 nap;
Humán genom szekvenálásának ára • Hagyományos (Sanger) módszer • HGP összköltsége: 3 milliárd $ • 2001-ben átlagosan 10$/bázis: • 2003: 300 millió $/ humán genom • Új generációs szekvenálás: • 2010: 7 nap Illumina; 10 ezer $ • 2013: 1,000 $ Complete Genomics
NGS • Exom-szekvenálás • Célzott szekvenálás • Bioinformatika
Microarray technológia • Nukleotid láncok hibridizálásán alapuló nagy felbontású technológia • Nukleotid próbákat kötnek szilárd hordozóra, ami lehet üveglapka-chip, illetve gyöngy Jelölt mintát hibridizálnak a próbákhoz • Jel intenzitást mérnek
Comparative genome hybridization = CGH • ArrayCGH = aCGH- genomiális DNS összehasonlítása microarray hibridizációval • Hátrány: VOUS- variants of uncertain clinical significance Kiegyensúlyozott transzlokációk és alacsony szintű mozaicizmus nem vizsgálható
aCGH klinikai felhasználása • Betegség fókuszált array-k • Hematológiai, onkológiai array-k • Prenatális array-k • Preimplantációs array-k
Már megszületett az első újszülött, akinek anyja korábban habituális vetélő volt, de a aCGH-val sikerült kiválasztani IVF-nél a megfelelő ivarsejteket. • aCGH a fejlődési rendellenességek 12%-át tudta kimutatni, a hagyományos kariotipizálás 2%-át. 200$ többletköltség/beteg. • VRONY= veleszületett Rendellenességek Országos nyílvántartása
Expressziós microarray • mRNS expressziós szintek összehasonlítására alkalmas a vizsgált mintákban/csoportokban • Komplex bioinformatikai elemzés jellemző (GSEA-gene set enrichment analízis, Pathway analízis) • Felhasználás pl.mikrobiológia-gazda patogén kölcsönhatás vizsgálata, gyógyszerfejlesztés, gyógyszer hatásvizsgálat, biomarker keresés (tumor diagnosztika)
Fiktív eset: Fragilis-X-szindróma • Egy 6 éves fiú ismeretlen eredetű középsúlyos értelmi fogyatékosság miatt került a gyermek-neurológiai szakrendelésre. • Egyéb tünete nem volt, azonban arca jellegzetes: • hosszúkás arc • előreugró (erőteljes) állkapocs • nagy, elálló fülek. Fénykép: http://www.ildongmom.com/servlet/service.FCntDselService?url=EmbryoSub2menu5 44 Erdélyi D
A FRAXA gén(17 exont tartalmaz) Exon 3 Exon 2 Exon 1 CGG-ismétlődés DNS mRNS CpG-szigetek 5’-UTR 3’-UTR kódoló szekvencia • CGG-ismétlődés: • 5-44 (54): normális - egészséges, stabil • 45-54: szürke zóna - egészséges, instabil • 55-230: premutáció - egészséges(*), utódja beteg lehet • 230-1000: teljes mutáció - beteg vagy hordozó nő 45 Erdélyi D
A fragilis-X-szindróma diagnosztikája Citogenetikai vizsgálat: folsav-hiányos tenyésztőfolyadék alkalmazásával megjelenő „töréspont” (ma már nem használják) PCR alapú vizsgálat (csak szűrővizsgálatként) Southern-blot alapú vizsgálat (jelenleg ezt tartjuk legalkalmasabbnak) 46 Erdélyi D
Citogenetikai vizsgálat • Hátránya: • nagyon munkaigényes, • soká ad eredményt • sok az álnegatív és álpozitív lelet p q q27.3 Forrás: www.mun.ca/biology/scarr/ Fragile_X_chromosome.htm 47 Erdélyi D
PCR-diagnosztika 1 2 3 4 5 6 7 8 M 89 78 • Egészséges férfi • Egészséges nő • Egészséges nő (homozigóta) • Szürke zóna, nő • Full-mutációs férfi • Full-mutációs nő • Premutációs nő • Premutációs férfi 50 35 32 30 28 22 20 26 48 1 2 3 4 5 6 7 8 M Erdélyi D
Southern-blot vizsgálat izotóppal jelzett próba Exon 1 EcoR I Eag I (metiláció-érzékeny: csak nem metilált szekvenciát hasít) EcoR I metiláció történik (a.) normálisan nőkben az egyik X-kromoszóma inaktivációjakor, vagy (b.) kóros esetben nagyon nagyszámú CGG-ismétlődés miatt 2,8 Kb 5,2 Kb 49 Erdélyi D
1: Egészséges férfi: 2,8 Kb nem-metilált fragmentum. 2: Premutációs férfi: kissé hosszabb rövid Kb fragmentum. 3,4: Full-mutációs férfiak: jelentősen hosszabb hosszú fragmentum. 5: Egészséges nő: 5,2 Kb metilált és 2,8 Kb nem-metilált fragmentum. 6: Premutációs nő: kissé hosszabb rövid és 5.2 Kb fragmentum. 7,8: Full-mutációs nők: jelentősen hosszabb hosszú fragmentum. 50 Forrás: http://www.compgene.com/fmr1.htm Erdélyi D