Laboratorium Diagnostiek AIHA Marijke Overbeeke Masja de Haas

1. Laboratorium Diagnostiek AIHAMarijke Overbeeke Masja de Haas

2. Patient P. geb 23-11-1942 • Meneer P. wordt op een vrijdagmiddag opgenomen met een Hb van 3.4. • Hij is geel en heeft een verhoogd bilirubine • LDH is sterk verhoogd • Reticulocyten zijn verhoogd • Spoedaanvraag bloedtransfusie • Aanvraag: • Directe Coombs en antistofscreening ivm transfusie

3. Klinisch informatief om onderscheid te maken welke antistoffen gebonden zijn Directe antiglobuline test (DAT) met poly-specifiek antiglobuline reagens, informatie over: DAT, kolomtechniek aan erytrocyt gebonden: of Ig (IgM, IgG, IgA) en/of complement DAT, buisjesmethode

4. Serologische kenmerken AIHA • Serologische kenmerken zijn een sleutel voor het afbraakmechanisme bij AIHA. • DAT: • IgG en/of IgA en/of IgM en/of complement • Eluaat: IgG/IgA of IgM Let op als iemand recent getransfundeerd is • Vrij circulerende antistoffen • IgG/IgA/IgM en optimale temperatuur om te binden • (Onderzoek naar hemolysinen)

5. AIHA indeling • Warmte autoantistoffen (82%) • Meestal IgG, • Zelden alleen IgA (ernstig ziektebeeld!) • Zelden alleen IgM met complement binding • Koude autoantistoffen (16%) • Autoagglutinatie door IgM • Soms IgG (DL antistoffen) • Complement binding • Soms tot 30 oC en 37 oC reactief • Combinatie warmte en koude antistoffen • Antistoffen tegen medicijnen en/of derivaten

6. Bloedbaan: IgM of IgG-veroorzaakte fixatie van complement en opbouw membrane attack complex: intravasculaire lysis Complement activatie tot MAC Afbraakmechanismen bij AIHA Milt: Met name IgG- of IgA gemedieerde extravasculaire lysis Lever: Met name complement-gemedieerde extravascualiare lysis

7. Patient P: serologisch onderzoek • Directe antiglobuline test (DAT) • Polyspecifiek 3+ anti IgA - • Anti IgG 3+ anti IgM - • Anti C3d - controle - • Eluaat positief met alle cellen 3+ • Serum onderzoek • IAT positief met alle cellen • 16oC negatief

8. Warmte autoantistoffen • In serum • rhesus specifiek bv auto anti e of auto anti D • rhesus “aspecifiek” tegen totaal rhesus eiwit gericht • combinatie specifieke en “aspecifieke”antistof • Kell “aspecifiek” tegen hele Kell eiwit gericht • Meestal zijn alle cellen uit panel positief en is het niet mogelijk • compatibel donor bloed te vinden

9. Alle cellen uit panel positief

10. Alle cellen uit panel positief • Vraag : • Zijn er naast de autoantistoffen ook alloantistoffen aanwezig? • Worden getransfundeerde donor- erytrocyten door alloantistoffen sneller en effectiever afgebroken dan door autoantistoffen? • Geen data bekend om deze vraag te beantwoorden

11. Hoe vaak komen alloantistoffen voor bij AIHA patienten? • In literatuur 15% - 43% • Enquete Vox Sanguinis 25% - 47%

12. Wanneer zijn alloantistoffen bij transfusie van een AIHA patient in ieder geval van belang? • als er complement bindende alloantistoffen aanwezig zijn (ander afbraakmechanisme) • als de anemie een andere oorzaak heeft (bv bij een bloeding) • als transfusie nodig is voor een chirurgische ingreep en er geen hemolyse is • In het algemeen moet men daarom bij transfusie van AIHA patient zoveel mogelijk rekening houden met aanwezigheid van alloantistoffen

13. Methoden om alloantistoffen aan te tonen • Verdunning van het serum 1:3 of 1:5 • Autologe adsorptie • Allogene adsorptie • Specifieke test voor aantonen complement bindende alloantistoffen • Typering antigenen; welke allo-antistoffen kan een patient maken of gemaakt hebben?

14. Werkwijze allogene adsorptie Serum Adsorptie Cel 1 Cel 2 Cel 3 panel panel panel

15. Allogene Adsorptie erytrocyten Donor cel 1 O CCDee kk Fy(a+b+) Jk(a+b-) SS Anti C D e k Fya Fyb Jka S +asp. Anti c E K Jkb s Donor cel 2 O ccDEE kk Fy(a+b-) Jk(a+b-) ss Anti C e K Fyb Jkb S Donor cel 3 O ccdee Kk Fy(a-b+) Jk(a-b+) ss Anti C D E Fya Jka S

16. Onderzoek naar complement bindende allo-antistoffen • Indirecte II staps anti complement test • Serum + screeningscellen • Incubatie (binding antistoffen) • Wassen (verwijdering niet gebonden antistoffen) • Toevoegen vers complement • Incubatie (binding complement) • Wassen (verwijdering niet gebonden complement) • Anti C3c (aantonen gebonden complement)

17. Typering van patient levert info over “mogelijke” of te vormen alloantistoffen • Let op als iemand getransfundeerd is!! • Rhesus, Kell type (monoclonale antistoffen) (DNA) • Kidd type (monoclonale antistoffen) (DNA) • Duffy type (DNA) • Ss type (monclonale antistoffen)(DNA) • Typering op DNA niveau is ook mogelijk na een transfusie

18. Transfusieadvies • Compatibel voor Complement bindende alloantistoffen • Compatibel voor alloantistoffen • Preventie alloantistofvorming (Rhesus en K ) (consensus CBO) • Compatibel voor specifieke autoantistoffen (in geval van ernstige hemolyse) als er geen sterke aspecifieke antistoffen zijn

19. Urgente gevallen…. • Serologische procedure adsorptie duurt tenminste 4-5 uur • Selecteer Rhesusfenotype compatibel en K negatieve erytrocyten • Selecteer zo mogelijk voor het Kidd type , Duffy, en S s type • (in volgorde)

20. Patient S geb 10-03-1970 • Mevrouw wordt opgenomen met een laag Hb (4.0) en heeft recent een virusinfectie gehad • DAT is positief met polyspec. AHG en anti C3d en controle is ook positief • Bij ABO/RhD bloedgroepbepaling een probleem: • Alles is positief, erytrocyten agglutineren al spontaan (autoagglutinatie) • Dit zijn IgM antistoffen • Transfusieadvies?

21. IgM koude auto antistoffen • Autoagglutinatie • Complement bindend • Koude agglutininesyndroom • Antistoffen reactief • < 15 C geen klinisch belang • > 15 C- 20 C correlatie met infectie • > 30 C hemolyse in vivo • Specificiteit: anti I, IH, H, i

22. IgM koude autoantistoffen bij mevr S • Bepaling DAT en ABO Rhesus na wassen 37oC zout • Onderzoek naar aanwezigheid van alloantistoffen bij 37oC verrichten.(voorkeur na adsorptie autoantistoffen door 4oC monster) • Onderzoek naar klinisch belang koude autoantistoffen bij 30oC verrichten (bij voorkeur met serum afgenomen op 37oC) • Vermijd toediening van erytrocyten direct uit de koelkast.

23. Patient T. geb 03-03-06 Kind 4jr Infectie gehad. Buiten gespeeld (winter) Na binnenkomst: bleek, rode urine Intravasculaire hemolyse, oorzaak? Transfusie advies?

24. Patient T. geb 03-03-06 • DAT alleen positief met anti Complement • serum negatief in IAT • enkele cellen soms zwak in kolom test Ivm klinisch verhaal onderzoek naar bifasische hemolysinen: alleen positief in Donath Landsteiner test

25. Bifasische hemolysinen • Intravasculaire hemolyse • Klinisch beeld kenmerkend: • antistoffen binden bij lage temperatuur in capillaire vaatjes • Complement activatie in circulatie bij 37C

26. IgG bifasische hemolysinen • DAT alleen positief met anti Complement • Meestal niet aantoonbaar in normale IAT • Specificiteit vaak anti P • Complement bindend IgG antistoffen en intravasculaire hemolyse veroorzakend • Bepaling complement gehalte: indien verlaagd: • soms P negatieve erytrocyten geindiceerd

27. Wanneer onderzoek AIHA? • Wanneer er hemolyse is • Wanneer er aanwijzingen zijn voor autoantistoffen bij het pretransfusieonderzoek • Laboratorium heeft “plicht” informatie uit onderzoek te melden aan behandelaar • Info over soort autoantistoffen is van belang voor debehandeling van de patient

28. Communicatie is belangrijk ziekenhuis lab Behandelend arts Referentie lab

30. IgM warmte auto antistoffen • altijd complement bindend !! • DAT positief met anti C3d • directe type intravasculaire hemolyse in vitro hemolyse met ery’s in PBS • indirecte type extravasculaire hemolyse in vitro hemolyse met enzym behandelde ery’s Vaak anti I

31. IgM warmte autoantistoffendirecte type • Compatibele transfusie meestal niet mogelijk! • In extreme gevallen kan overwogen worden I negatieve erytrocyten te ontdooien • Bepaling complementgehalte :indien verlaagd • gewassen erytrocyten, vermijd toediening extra complement

32. IgM warmte autoantistoffenindirecte type • Bij antistofscreening en kruisproeven vaak “onverklaarbare” agglutinatie reacties in BSA IAT, PEG IAT en/of LISS IAT • Test voor hemolysinen • Screening herhalen met anti IgG en/of na DTT behandelen

33. (Auto) immuun hemolytische anemie positieve DAT • Autoantistoffen • Hemolytische anemie • gecompenseerde erytrocytenafbraak • geen erytrocytenafbraak • antistoffen tegen medicijnen/derivaten • alloantistoffen • (uitgesteld) hemolytische transfusiereactie • Hemolytische ziekte pasgeborene

34. (Auto) immuun hemolytische anemie positieve DATandere oorzaken • (beenmerg) transplantatie (anti A / B) • Intraveneusgammaglobuline (anti A / B) • Trombocytenconcentraat (anti A / B)

35. Patient met positieve DATmedische anamnese • Hemolyse?? Hemolyse parameters • Transfusie en zwangerschapsanamnese? • Transplantatie? • Medicijnen? • Intraveneus gammaglobuline? • Trombocytenconcentraat?