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Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatakarzinomzelllinien

Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatakarzinomzelllinien. Doreen Kunze 21.02.05. Zeitabhängigkeit (Ernte 12-72 h nach TF-Start) Konzentrationsabhängigkeit (50-1000 nM) Bestimmung der Apoptoserate Behandlung mit dem p38-MAPKinase-Inhibitor SB203580. Gliederung.

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Presentation Transcript

  1. Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatakarzinomzelllinien Doreen Kunze 21.02.05

  2. Zeitabhängigkeit (Ernte 12-72 h nach TF-Start) Konzentrationsabhängigkeit (50-1000 nM) Bestimmung der Apoptoserate Behandlung mit dem p38-MAPKinase-Inhibitor SB203580 Gliederung

  3. Zelllinie: PC-3 Transfektionsbedingungen: Konzentration siRNA: 250 nM siRNA : DOTAP = 1 : 4 TF-Zeit: 4 h Ernte nach 12, 24, 48 und 72 h RNA-Isolierung, cDNA-Synthese quantitative RT-PCR 1. Zeitabhängigkeit

  4. siRNA-Konstrukte: Sekundärstrukturvorhersage: D1 (2245-2263 bp) 10x10 D2 (2215-2233 bp) 13x10 D3 (1024-1042 bp) 1x10 1x9 D4 (440-458 bp) 9x10 1x9 D5 (1288-1306 bp) 2x10 3x9 axb: a – Anzahl der Nukleotide im Konstrukt die b erfüllen b – WSK, dass Nukleotid in 10 vorhergesagten Sekundärstrukturen einzelsträngig ist ( 10 = 100 % ) 1. Zeitabhängigkeit

  5. Ergebnisse: Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression (relativ zu PBGD), normiert auf ns-siRNA 1. Zeitabhängigkeit

  6. Ergebnisse: Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression (relativ zu PBGD), normiert auf ns-siRNA 2. Konzentrationsabhängigkeit

  7. TF mit siRNA-D5 (125 nM) Apoptosemessung 24, 48 und 72 h nach TF-Start 3. Bestimmung der Apoptoserate siRNA-D5 48 h ns-siRNA 48 h unbehandelt 48 h

  8. 4. Behandlung mit dem p38-MAPKinase-Inhibitor SB203580 - Signalübertragung durch intrazelluläre Proteinkinasen-Kaskaden - MAPK = mitogen-aktivierte Proteinkinase

  9. Zelllinien PC-3 und BPH-1 1-3 Tage Medium ohne FKS zur Streßaktivierung der p38MAPK Behandlung mit SB203580 (0,5 µM – 8 µM) 1. versch. Inkubationszeiten des Inhibitors (10 min – 4 h) 2. 1 h Inkubation, 10 min bzw. 1 h Restimulation Restimulation durch D-MEM mit FKS 3. 1 h Inkubation 4. Behandlung mit dem p38-MAPKinase-Inhibitor SB203580

  10. 4. Behandlung mit dem p38-MAPKinase-Inhibitor SB203580

  11. 4. Behandlung mit dem p38-MAPKinase-Inhibitor SB203580

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