Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatakarzinomzelllinien

1. Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatakarzinomzelllinien Doreen Kunze 09.05.05

2. P38IP / C13ORF19 / FAM48A • mRNA-Expression in malignem Prostata-Gewebe runterreguliert • lokalisiert auf 13q12-14 zwischen 2 Tumorsuppressorgenen (BRCA-2 und RB-1) • Vermutung: Tumorsuppressor- oder Metastasen- suppressorfunktion in Prostatagewebe

3. Gliederung • siRNA-Behandlung der Zelllinie PC-3 • soft agar assay • siRNA-Behandlung der Zelllinie BPH-1 • Chemoprotektion

4. siRNA-Behandlung PC-3

5. 5,5 % 4,9 % 4,3 % unbehandelt 48 h siRNA-D5 48 h ns-siRNA 48 h siRNA-Behandlung PC-3 Tf mit 125 nM siRNA Zellzyklusmessung Apoptosemessung

6. soft agar assay • im Gegensatz zu Tumorzellen benötigen nichtmaligne Epithelzellen Stromazellen als „Wachstumsfläche“ • Transformation der Zellen erkennbar an Fähigkeit auf soft agar zu wachsen • 3D-Wachstum in die Agarose hinein möglich • Unterschiedliches Wachstumsverhalten siRNA-D5-behandelter Zellen im Vgl. zu ns-siRNA-behandelten bzw. zu unbehandelten? • im Bild dargestellt: • Koloniebildung bei A549 (Lungenkarzinom) • vergrößerte Kolonie • Keine Kolonien bzw. lebenden Zellen bei MRC-5 (normale Lungenfibroblasten)

7. soft agar assay • 6 well-MTP: pro well 2 ml 0,5 % Agarose in H2O • Zellen mit 4 ml Medium zugegeben (PC-3: 500 – 5000 Zellen/well) • 14 Tage Kultivierung unter Zellkulturbedingungen • 30 Min mit 4% Formaldehyd fixiert • Färbungen: • Giemsa (30 Min – 24 h) • Nach 24 h Färbung Kolonien sehr gut sichtbar • Ethidiumbromid • 50 µg EtBr + 450 µl PBS (10 Min) • Leuchtet sehr stark • Agarose entfärbt sich langsam beim Waschen mit PBS (trotzdem noch starker Hintergrund) • Zellen vollständig gefärbt • 1 µg EtBr + 499 µl PBS (24 h) • nach 24 h Färbung unter Fluoreszenzmikroskop nur schwaches Leuchten der Zellen erkennbar

8. soft agar assay Ethidiumbromid Giemsa

9. siRNA-Behandlung BPH-1 • WST-1-Test • Tf mit 125 bzw. 250 nM siRNA-D5, WST-1-Test 24, 48 bzw. 72 h nach Tf-Start

10. siRNA-Behandlung BPH-1 • Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit • Tf mit 125 bzw. 250 nM siRNA-D5, Ernte 24 bzw. 48 h nach Tf-Start

11. siRNA-D5 125 nM 18,5 % siRNA-D5 250 nM 32,5 % Unbehandelt 31,3 % ns-siRNA 125 nM Apoptose: 21,6 % siRNA-D5 125 nM ohne Dotap 41 % ns-siRNA 250 nM Apoptose: 40,4 % siRNA-Behandlung BPH-1 • Apoptosemessung (Tf mit 125 bzw. 250 nM siRNA-D5, Ernte 48 h nach Tf-Start)

12. siRNA-Behandlung BPH-1 • Zellzyklusmessung • Tf mit 125 bzw. 250 nM siRNA-D5, Ernte 24 bzw. 48 h nach Tf-Start

13. 24 – 72 h 20 h 24 – 72 h WST-1-Test Zellzählung RNA-Isolierung Apoptosemessung Zellzyklustest Zellkoloniebildungstest CT (24 h) Aussaat Transfektion (4 h) Chemoprotektion • Hypothese: P38IP-Hemmung verbessert Proliferation der PCa-Zellen • wegen geringer Apoptoserate Effekt nicht erkennbar • Erhöhung der Apoptoseraten durch Behandlung mit Chemotherapeutika (CT)

14. Chemoprotektion • WST-1-Test:

15. Chemoprotektion Tf mit 250 nM siRNA (2 unabhängige Experimente) • WST-1-Test:

16. Chemoprotektion Konzentrations-abhängigkeit mit Docetaxel Tf mit 250 nM siRNA • WST-1-Test:

17. Chemoprotektion • PC-3 • siRNA: 250 nM • Etoposid: 20 µM Zellzählung

18. Chemoprotektion • Apoptosemessungen • PC-3 • siRNA: 250 nM • Etoposid: 20 µM

19. Chemoprotektion Zellzyklusmessung • PC-3 • siRNA: 250 nM • Etoposid: 20 µM • 72 h nach Tf

20. siRNA-D5 + Etoposid siRNA-D5 Etoposid

21. Ausblick • P38IP → P38Map-Kinase-Interfering Protein • Einfluss von siRNA-D5-Behandlung auf P38MAPK ? • AK gegen P38MAPK (phoshpo und gesamt) → Western Blot