Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatazelllinien

1. Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften Technische Universität Dresden Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatazelllinien Doreen Kunze 21.07.05

2. Einleitung 2 • Prostatakarzinom (PCa) • häufigste Krebserkrankung bei Männern • zweithäufigste Krebs-Todesursache • Lebenszeitrisiko: • zu erkranken: 9,6 % • zu sterben: 3,2 % • Häufigkeitsgipfel zw. 70. – 75. Lebensjahr • genetisch und tumorbiologisch sehr heterogen

3. Einleitung 3 • Tumorentwicklung • Überexpression von Onkogenen und/oder funktionelle Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen (TSG) • PCa: • Onkogene: Progression • TSG: Entstehung • → häufig Allelverluste (LOH – loss of heterozygosity) auf den Chromosomen- abschnitten 8p und 13q

4. BRCA2 C 13 13 RB1 Chromosom 13 In situ-Hybridisierung von Prostatagewebe mit P38IP-mRNA (Schmidt et al. 2001) Einleitung 4 P38IP (C13orf19, FAM48A) • lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei Tumorsuppressorgenen • LOH-Ereignisse • mRNA-Expression in primären PCa reduziert • Hypothese:Tumorsuppressorfunktion in Prostatagewebe • → verbesserte Proliferation der PCa-Zellen nach Inhibierung der • P38IP-mRNA-Expression

5. zelluläre Kinase siRNA Bildung von RISC RISC siRNA-Entwindung ATP ADP + Pi Aktivierter RISC Anlagerung von RISC an Target-mRNA Zellkern polyA Target-mRNA Target-mRNA- Spaltung polyA polyA Target-Gen Sequenzspezifisches Gensilencing Einleitung 5 siRNA (small interfering RNA) • Bestandteil der RNA- • Interferenz • posttranskriptionelle • Geninhibierung • 2 nt-3`-Überhänge • 5`-Phosphatgruppen • antisense-Strang aktiviert • RISC (RNA induced • silencing complex) modifiziert nach D. Bauer

6. Ziele 6 • Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene ? • Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK ? • Androgenabhängigkeit der P38IP-mRNA-Expression ?

7. 24 – 72 h 20 – 68 h WST-1-Test Zellzählung RNA-Isolierung + qPCR Apoptosemessung Zellzyklustest Zellkoloniebildungstest Aussaat (PC-3, BPH-1) siRNA-Transfektion (4 h) 7 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition Zeit- und Konzentrationsabhängige Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression bei PC-3-Zellen: P38IP-mRNA-Expression/PBGD, normiert auf ns-siRNA • effektive, langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression

8. 8 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition WST-1-Test → keine Kurz- und Langzeit- Proliferations- effekte Zellkoloniebildungstest

9. Apoptosemessung (FACS) 4,3 % unbehandelt 5,5 % 4,9 % siRNA-D5 ns-siRNA 9 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition Zellzyklusverteilung → keine Zellzyklus- veränderungen → keine Veränderung der Apoptoserate

10. 24 – 72 h 20 h 24 – 72 h WST-1-Test Zellzählung Apoptosemessung Zellzyklustest CT (Etoposid, Docetaxel; 24 h) Aussaat (PC-3) Transfektion (4 h) 10 1.2 Kombinationsbehandlung mit siRNA-D5 und Chemotherapeutika • keine verstärkte Reduktion der Zellzahl • keine Apoptoseinduktion

11. 11 1.2 Kombinationsbehandlung mit siRNA-D5 und Chemotherapeutika Zellzyklusverteilung • Zellzyklusarrest • keine Wachstums-veränderungen verglichen mit den Kontrollen 125fache Vergrößerung A: PC-3 siRNA-D5 B: PC-3 siRNA-D5 + Etoposid

12. Zusammenfassung 1.Teil 12 Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene •  Langanhaltende und effektive Geninhibition durch siRNA • P38IP hat keinen Einfluss auf das Wachstum der untersuchten Prostatazelllinien • verminderte Expression nicht ursächlich mit PCa-Entstehung verbunden • möglicherweise mit Progression der Karzinome assoziiert oder Begleiterscheinung der zunehmenden genetischen Instabilität auf dem Chromosom 13q

13. Quelle: www.cellsignalingtechnology.com 13 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK • P38IP = p38MAPK interacting protein • MAPK = mitogenaktivierte Proteinkinase • intrazelluläre Signalübertragung (Proteinkinasen-Kaskaden) • stressaktiviert • 4 Isoformen (α, β, γ, δ) • SB203580 inhibiert p38α und p38β durch Bindung an ATP-Bindestelle

14. 14 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK Inhibition der P38IP- mRNA-Expression mit siRNA-D5 Expression und Phosphorylierungsstatus der p38MAPK Inhibition der p38MAPK durch SB203580 P38IP-mRNA-Expression

15. unbehandelt unbehandelt unbehandelt siRNA-D5 siRNA-D5 siRNA-D5 ns-siRNA ns-siRNA Marker PC-3 p38MAPK (gesamt) β-Actin phospho-p38MAPK β-Actin Erntezeitpunkt nach Transfektion: 72 h 96 h 72 h 15 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK 1. Inhibition der P38IP-Expression mit siRNA-D5 • Phosphorylierungsstatus der p38MAPK ändert sich nicht

16. 16 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Ergebnisse) 2. Inhibition der p38MAPK durch SB203580 • kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK

17. 24 h 24 h 3 – 48 h Aussaat (LNCaP) Hormonfreies Medium Androgen R1881 (+ Bicalutamid) RNA-Isolierung + qPRC 3. Androgenabhängigkeit 17 • P38IP-mRNA-Expression ist nicht androgenabhängig

18. Zusammenfassung 18 • P38IP besitzt keine Tumorsuppressor-funktion in den untersuchten Zelllinien • Genbezeichnung: C13orf19 oder FAM48A • kein Zushang • P38IP-mRNA-Expression ist androgen-unabhängig