Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatakarzinomzelllinien

1. Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften Technische Universität Dresden Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatakarzinomzelllinien Doreen Kunze 20.05.05

2. Ziele • Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene • Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK • Hormonabhängigkeit der P38IP-mRNA-Expression

3. Prostatakarzinom (PCa) häufigste Krebserkrankung bei Männern zweithäufigste Krebs-Todesursache Lebenszeitrisiko: Zu erkranken: 9,6 % Zu sterben: 3,2 % Häufigkeitsgipfel zw. 70 – 75 Lebensjahr genetisch sehr heterogen 1. P38IP-mRNA-Inhibition (Einleitung)

4. BRCA2 C 13 13 RB1 Chromosom 13 Kernlokalisierungssignal PEST-Region 733 AA N C a-Helix-Region Glutamin-Cluster In situ Hybridisierung von Prostatagewebe mit P38IP Schematische Darstellung des längsten offenen Leserahmens im P38IP-Gen und das abgeleitete Proteinmuster. P38IP 1. P38IP-mRNA-Inhibition (Einleitung) • C13ORF19, Fam48A • lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei Tumorsuppressorgenen • mRNA-Expression im PCa reduziert • Hypothese: Tumorsuppressorfunktion in Prostatagewebe: verbesserte Proliferation der PCa-Zellen nach Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression

5. 24 – 72 h 20 – 68 h WST-1-Test Zellzählung RNA-Isolierung + qPCR Apoptosemessung Zellzyklustest Zellkoloniebildungstest Western Blot Aussaat (PC-3, BPH-1) Transfektion (4 h) 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (M & M, Ergebnisse) • M & M: • Ergebnisse: Tf mit 250 nM siRNA: 24 h nach Tf:

6. Apoptosemessung (FACS) - Tf mit 125 nM siRNA 5,5 % 4,9 % 4,3 % unbehandelt 48 h siRNA-D5 48 h ns-siRNA 48 h 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (Ergebnisse) WST-Test 48 h nach Tf Zellkoloniebildungstest

7. 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (Ergebnisse) • langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression • keine Kurz- und Langzeit- Proliferationseffekte

8. 24 – 72 h 20 h 24 – 72 h WST-1-Test Zellzählung Apoptosemessung Zellzyklustest CT (Etoposid, Docetaxel; 24 h) Aussaat (PC-3) Transfektion (4 h) 1.2 Chemoprotektion (M & M, Ergebnisse) • M & M: • Ergebnisse: WST-1-Test: 96 h nach Tf

9. A B 125fache Vergrößerung A: PC-3 siRNA-D5 B: PC-3 siRNA-D5 + Etoposid 1.2 Chemoprotektion (Ergebnisse) • Zellzyklusarrest, keine Apoptoseinduktion

10. 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Einleitung) • P38IP = p38MAPK interacting protein • MAPK = mitogen-aktivierte Proteinkinase • intrazelluläre Signalübertragung (Proteinkinasen-Kaskaden) • streßaktiviert • 4 Isoformen (α, β, γ, δ) • SB203580 inhibiert p38α und p38β durch Bindung an ATP-Bindestelle

11. 24 – 72 h 24 – 72 h 10 – 60 min Zellzählung RNA-Isolierung + qPCR Western Blot (HSP27) Aussaat (PC-3, BPH-1) DMEM ohne FKS SB203580 (0,5 – 8 µM) 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (M & M, Ergebnisse) • M & M: • Ergebnisse: • kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK erkennbar

12. 2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Ergebnisse, Ausblick) • Ergebnisse: ß-Actin HSP 27 • HSP27 ist kein geeigneter Nachweis für p38MAPK-Inhibition • Ausblick: • Einfluss von siRNA-D5-Behandlung auf p38MAPK ? • (Western Blot mit AK gegen p38MAPK)

13. 24 h 24 h 3 – 48 h Aussaat Hormonfreies Medium Androgen R1881 (+ Casodex) RNA-Isolierung + qPRC 3. Hormonabhängigkeit (M & M, Ergebnisse) • M & M: • Ergebnisse: • P38IP-mRNA-Expression ist nicht hormonabhängig

14. Zusammenfassung •  langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression • keine Kurz- und Langzeit- Proliferationseffekte • kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK • P38IP-mRNA-Expression ist nicht hormonabhängig Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !