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Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatakarzinomzelllinien Ergebnisse PC-3. Doreen Kunze 03.05.05. Zeitabhängigkeit (Ernte 12-72 h nach TF-Start) Konzentrationsabhängigkeit (50-1000 nM) Bestimmung der Apoptoserate Zellzyklusmessung WST-Test (siRNA-D3 und D5)
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Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei ProstatakarzinomzelllinienErgebnisse PC-3 Doreen Kunze 03.05.05
Zeitabhängigkeit (Ernte 12-72 h nach TF-Start) Konzentrationsabhängigkeit (50-1000 nM) Bestimmung der Apoptoserate Zellzyklusmessung WST-Test (siRNA-D3 und D5) Zellkoloniebildungstest Gliederung
Zelllinie: PC-3 Transfektionsbedingungen: Konzentration siRNA: 250 nM siRNA : DOTAP = 1 : 4 TF-Zeit: 4 h Ernte nach 12, 24, 48 und 72 h RNA-Isolierung, cDNA-Synthese quantitative RT-PCR 1. Zeitabhängigkeit
siRNA-Konstrukte: Sekundärstrukturvorhersage: D1 (2245-2263 bp) 10x10 D2 (2215-2233 bp) 13x10 D3 (1024-1042 bp) 1x10 1x9 D4 (440-458 bp) 9x10 1x9 D5 (1288-1306 bp) 2x10 3x9 axb: a – Anzahl der Nukleotide im Konstrukt die b erfüllen b – WSK, dass Nukleotid in 10 vorhergesagten Sekundärstrukturen einzelsträngig ist ( 10 = 100 % ) 1. Zeitabhängigkeit
Ergebnisse: Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression (relativ zu PBGD), normiert auf ns-siRNA 1. Zeitabhängigkeit
Ergebnisse: Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression (relativ zu PBGD), normiert auf ns-siRNA 2. Konzentrationsabhängigkeit
TF mit siRNA-D5 (125 nM) keine signifikanten Unterschiede !!! Apoptosemessung 24, 48 und 72 h nach TF-Start 5,5 % 4,9 % 4,3 % siRNA-D5 48 h ns-siRNA 48 h unbehandelt 48 h 3. Bestimmung der Apoptoserate
TF mit siRNA-D5 (250 nM) bei siRNA-D5 waren seltsamer Weise viele Zellen gestorben !!! Apoptosemessung 24, 48 und 72 h nach TF-Start 3. Bestimmung der Apoptoserate siRNA-D5 48 h ns-siRNA 48 h unbehandelt 48 h
TF mit siRNA-D5 (125 nM) Zellzyklusmessung 24, 48 und 72 h nach TF-Start 4. Zellzyklusmessung
TF mit siRNA-D5 (250 nM) NICHT !! Zellzyklusmessung 24, 48 und 72 h nach TF-Start 4. Zellzyklusmessung
5. WST-Test siRNA-D3 und D5 - Transfektion der PC-3-PCa-Zellen mit siRNA-D3 und D5 (125 und 250 nM)
6. Zellkoloniebildungstest - Transfektion der PC-3-PCa-Zellen mit siRNA-D5 (125 und 250 nM)