Biotecnologia Médica I

1. Biotecnologia Médica I Aula teórica IV

2. Biotecnologia • “Qualquer aplicação tecnológica que usa sistemas biológicos, organismos vivos ou derivados destes, produzindo ou modificando processos para um uso específico”. – CDB 92.

3. Conhecimento • Genética; • Bioquímica; • Microbiologia; • Biologia Molecular; • Fisiologia; • Imunologia; • Ciências do materiais; • Ciências da computação; • Engenharia química.

4. Técnicas • Engenharia de proteínas; • Engenharia de tecidos; • Engenharia genética; • Tecnologia do bioprocessamento; • Tecnologia de biosensores; • Tecnologia do antisenso; • Tecnologia dos anticorpos monoclonais; • Tecnologia de chip de DNA; • Tecnologia de cultura de tecidos e células;

5. Aplicações: • Monitoramento ambiental • Biorremediação • Prevenção da poluição • Rendimento de safras • Qualidade de alimentos • Saúde animal • Diagnósticos • Terapias • Vacinas Meio ambiente Agricultura Medicina

6. Biotecnologia Industrial e ambiental – Escalas comerciais e industriais

7. Biotecnologia Agrícola – Produção e saúde animal e vegetal

8. Biotecnologia Médica – Saúde humana

9. Biotecnologia e a importância mundial • Índice de desenvolvimento humano – 2001; • HIV/AIDS, tuberculose e malária, revolução verde; • Bio-economia • Produção de colheita, produção animal, silvicultura etc; • Agroquímicos, sementes, energia, alimentos, farmacêutica e assistência médica. • Impacto ambiental; • 2001 – US$ 34,8 bilhões – 200 mil empregos; • P&D e inovação tecnológica; • 97 % - EUA, Canadá e Europa. Principalmente área médica.

10. Histórico • 1797: Jenner e a vacina da varíola; • 1857: Pasteur propões que micróbios fermentam; • 1928: Flemming e a penicilina; • 1944: DNA carrega a informação; • 1953: Dupla hélice do DNA; • 1967: Primeira sequencia proteica; • 1970: Enzimas de restrição; • 1973: Bacteria com DNA recombinante; • 1977: Expressão de proteína humana em bactéria; • 1980: Pedido de patente para clonagem; • 1982: FDA aprova primeira droga recombinante; • 1983: PCR; • 1986: Vacina recombinante; • 1988: Animal modificado geneticamente; • 1990: Início do projeto genoma humano; • 1994: Dnase para fibrose cística; • 1997: Animal clonado de uma célula adulta – Dolly; • 2002: Genoma humano publicado.

11. Biotecnologia Médica • Entendendo a causa de doenças; • Identificando marcadores diagnósticos; • Identificando potenciais alvos para intervenção médica; • Provendo novas formas de terapias.

12. Entendendo a causa da doença Nocaute gênico: ruptura direcionada de genes específicos. • Utilizações: • Papel do gene em indivíduos saudáveis: ex. camundongos nocauteados para enzimas de reparo de DNA no estudo de câncer; • Papel do gene nos patógenos: ex. proteínas de membrana envolvidas na invasão de células.

13. Identificando marcadores diagnósticos • Conhecimento das características de uma doença para fazer um prognóstico sobre a evolução e possibilitar uma intervenção. • Diagnóstico molecular – técnicas de biologia molecular para o estudo do DNA/proteínas de: • Gravidez; • Doenças infecciosas; • Câncer; • Doenças Genéticas.

14. Doenças infecciosas Detecção do microrganismo X Detecção da resposta imune

15. Detecção do microrganismo • Genoma • PCR, Hibridização; • H1N1, Helycobacter etc.

16. Detecção do microrganismo • Proteínas • Aglutinação, ELISA; • HIV/AIDS, leptospirose.

17. Detecção do microrganismo • Visualização direta • Técnicas de coloração, imunofluorescência; • Tuberculose etc.

18. Detecção do microrganismo • Isolamento em cultura: • Cultura direta • Cultura de células • Doenças virais – efeito citotóxico, tuberculose etc.

19. Detecção da resposta Imune • Fase da infecção; • Primária ou secundária; • HIV/AIDS, toxoplasmose, sífilis etc.

20. Ex. dignóstico molecular de AIDS/HIV ELISA (enzyme-lynked immunosorbant assay) • 1. Placa com anticorpos anti-proteína da cápsula do vírus HIV; • 2. Amostra de soro do paciente é adicionada; • 3. Incubação e lavagem – complexo Ac-vírus; • 4. Adição de Ac anti-proteína da cápsula do vírus conjugados com uma enzima – complexo Ac-vírus-Ac; 00 • 5. Adição do substrato para a enzima – emissão de cor, luz; 00 • 6. Detecção da intensidade desta luz/cor (espectofotômetria) e resultado final.

22. Reação enzima-substarto

23. Câncer • Tradicional: • radiografia, tomografia, biópsia etc; • Problemas: • Estágio avançado; • Testes Invasivos. – exame de próstata, colo do útero, leucemia.

24. Câncer • Molecular: • Sequenciamento de DNA: oncogenes e supressores de tumor; • Citogenética: rearranjos cromossomais - FISH; • Imunohistoquímica – identificação tecidual; • Proteômica – marcadores tumorais.

25. Ex. diagnóstico molecular de câncer FISH (fluorescent in situhybridization) 1. Lâmina com cromossomo na metáfase fixado; 2. Adição de formamida – desnatura mas mantém a forma; 3. Adição da sonda – sequencia de DNA complementar a uma região do cromossomo marcada com fluorescência; 4. Hibridização da sonda-cromossomo – emissão de fluorescência e visualização do local físico onde hibridizou. 5. Interpretação: - Posição esperada = sem mutação - Posição não esperada = mutação por recombinação e câncer

26. Doenças genéticas • Intolerância a lactose, albinismo, predisposição a doenças cardíacas, hemofilia, síndromes etc; • Aconselhamento genético; • Testes: • Citogenético: FISH; • DNA: PCR, sequenciamento; • Metabólico: Eletroforese de proteínas.

27. Ex. diagnóstico de doenças genéticas SNP (singlenucleotidepolymorphisms) • Único nucleotídeo mutado altera a proteína; 1. Sequenciamento do gene; 2. Comparação com banco de dados; 3. Identificação do local da mutação e da doença .

28. Ciência forense • Impressão genética – identificar indivíduos com base no DNA. • Como? • TR: tandem repeats ou sequencias satélites – sequencias repetitivas similares entre humanos relacionados mas diferentes entre não relacionados. • PCR • Sequenciamento de DNA • RFLP • AFLP • Eletroforese capilar

30. Fármacos naturais • Top 5: US$ 37, 3 bilhões – 2006; • Câncer, HIV/AIDS, cardiovasculares, respiratórias, doenças infecciosas; • Geralmente moléculas pequenas (63%); • De onde vem? Digitalispurpurea– doenças cardíacas; Teixo – câncer de ovário e de mama; Saliva de carrapatos – anticoagulantes; Veneno de rãs – analgésico; Bactérias ambientais – antibióticos.

31. Fármacos naturais – como descobrir? • Genômica, bioinformática - identificação de potenciais alvos; • Técnicas de cromatografia - separação e extração de moléculas; • Eletroforese e HPLC - identificação do peso molecular e da sequencia proteica; • Cristalografia, difração de raio-X ou ressonância nuclear magnética - identificação da estrutura química e espacial da molécula; • Testes celulares - identificação de propriedades terapêuticas;

32. Fármacos naturais – como produzir? • Pesquisadores coletaram 2400 kg de esponjas para obter 1 mg de droga anti-câncer = desastre ecológico. • Solução I: cultura de células de esponja. • Solução II: clonagem dos genes necessários para produzir o composto em uma bactéria/levedura e fazer fermentação desta cultura.

36. Fármacos endógenos • Diabetes mellitus, albinismo, hemofilia etc – falta de um metabólito próprio do corpo – erros inatos do metabolismo. Insulina Clonagem molecular

37. Biopolímeros de uso médico • Polímeros produzidos por organismos. • Superiores aos inôrgânicos – compatibilidade e absorção. • Articulações e tendões; • Ossos; • Implantes dentários; • Próteses de vasos sanguíneos; • Implantes de seios; • Lentes de contato; • Tratamento de artrite – hialuronato; • Cicatrização; • Antimicrobianos – quitina.

38. Biopolímeros de uso médico • Vantagens: • Derivados de fontes de energia renováveis; • Diminui a emissão de poluentes; • Menor custo; • Biodegradáveis e absorvidos; • Biocompatíveis; Saccharum - PLA, PHBV e amidos termoestáveis Alcaligeneseuthrofus

39. Xenotransplantes • 250 mil transplantes anualmente; • 1:4 - doadores:pacientes; • 1963: rim de chimpanzé em humanos; • Suínos – tamanho, fisiologia, anatomia, baixo custo, crescem rapidamente e técnicas estabelecidas; • Células bovinas e o Mal de Parkinson; • Suínos para regeneração de medula óssea.

40. Problema: rejeição – HAR e AVR. Alternativa: Transgênese com proteínas inibitórias humanas, retirada de antígenos;