Dystrophinopathia: út a genetikai diagnosztikától a terápiáig

1. Dystrophinopathia: út a genetikai diagnosztikától a terápiáig Endreffy Emőke, László Aranka SZTE Gyermekklinika, Szeged

2. p Xp21.2 /dystrophin gén/ q X kromoszóma Dystrophinopathiak (DMD/BMD) • DMD: XR öröklődésű, lethalis, progresszív izomvesztéssel járó neuromuscularis genetikai kórkép (1/3 500 fiú, BMD 1/30 000 fiú). • Betegek: 2/3-a deletios, 1/3-a új mutációt hordoz • Gén: Xp21 régió, 2.22Mb, 79 exon, 2 deletios ”forró pont ” 7 szövet specifikus promóter, számos splice variáns (5 izoforma). • mRNS: 11kb. Dystrophin: 3685aa, 427kDa, 4 domain, subsarcolemmalis fehérje (”lehorgonyzó” szerep, mechanikai stabilitás). • Expresszió: izomban (váz-, szív-, simaizom) és az agyban. 1g izomban 114 billió dystrophin molekula van! • Geno/fenotípus összefüggések: frameshift hipotézis (92%). • Oki terápia: jelenleg nincs, majd a génterápia lesz. • Molekuláris genetikai vizsgálatok célja: diagnózis megerősítése, (prognózis?), carrier kimutatás, praenatalis diagnosztika, újabban:génterápia!

3. Normál izomszövet DMD beteg A dystrophin lokalizációja az izomszövetben Adystrophinhoz kapcsolódó glikoprotein komplex sematikus ábrája a sarcolemmán keresztül. A dystroglikan komplex lehorgonyozza a cytoskeletális mikrofilamentumokat a dystrophinen és lamininen keresztül az extracelluláris matrixhoz. A sarcoglycan komplex komponenseit más gének kódolják.

4. STR-45 D/569 D/570 D/571 D/572 Mw D/ 695 D/566 D/591 D/593 D/692 547bp (e45) 506bp (e48) 459bp (e19) 416bp (e17) 360bp (e 8) 268bp (e 44) D/569: P. E. (apa) D/570: G. E (anya) D/571: P. E. (DMP-s fiú) D/572: R. E. (leánytestvér) Molekuláris genetikai vizsgálatok DMD/BMD-ben • 19 génszakasz vizsgálata: Pm és 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 60 exonok, melyek leggyakrabban szenvednek deletiot. • Deletiós fiúbeteg: 107 (63%), nem deletiós63 (37%) • Családvizsgálat 8 STR markerekkel: 122 • Prenatalis diagnosztika: 49, 36 fiúmagzatból: 26egészséges (72%), 10 beteg. • 13leánymagzat: carrier vizsgálat mikor (EU előírások!)? Csapdák: pontos-e a diagnózis? Informatív-e a marker? A család kapott tájékoztatást a betegség örökletes voltáról? Történt-e gén rekombináció a családon belül?

5. Ismeretük a személyre szóló terápiás lehetőségek miatt fontos! 106 dystrophinopathiás betegünk deletioi

6. 106 dystrophinopathiás betegünk exon deletioinak gyakorisága

7. Egy gyógyszer kipróbálás fázisai: • Pre-klinikai fázis: laboratóriumi vizsgálatokkal, állatkísérletekkel. Célja: biológiai aktivitás és biztonság, adagolási forma meghatározása. • Klinikai fázis I: 20-100 egészséges felnőtt önkéntesen, biztonsági elemzés. • Klinikai fázis II: 100-500 önként jelentkező betegen, az optimális dózis, biztonság, hatásosság vizsgálatához. • Klinikai fázis III: 1000-5000 betegen a biztonságosság, hosszú távú hatásosság igazolására. Egy új gyógyszer molekula megtalálása, bevezetése 15 évig is eltarthat és költsége 500 millió USA dollár körüli!

8. Génterápiás próbálkozások-még nem klinikai kipróbálás szintjén: • Mikro gén bevitele: adeno-asszociált vírus vektorral (AAV) mini dystrophin cDNS bevitele (hiányzik a 17. exon egy része és 18-59-ig az összes, valamint a 70-79-es exonok). Nem gyógyít, BMD formává transzformál. Nem mutáció specifikus, minden DMD-s beteg kaphatja majd (Biostrophin inj.) • Gén transzfer plazmiddal (kis cirkuláris „csupasz” DNS-el): a teljes gén kódoló és szabályozó régióival. • Myoblast sejt transzplantáció (Kanada): átmeneti javulás, újabb próbálkozás: myostatin blokkolás kíséretében. Egyelőre immunosuppresszív terápiával. • Őssejtekkel:lehetséges izom regeneráció: • differenciálódó (Pax3 transzkripciós faktor segítségével) embrionális őssejtek közül kinyert myogen sejtekkel (intakt dystrophin génnel), • izom őssejtekkel (mesoangioblastok és pericyták), mini cDNS-el korrigálva, • Genetikailag exon-kiütött saját őssejtekkel (szatellita sejtek).

9. Terápia farmakológiai ágensekkel: • Utrophin gén (kr. 6, 75 exon) „aktiválás”, mivel a kódolt fehérje (A-utrophin) a dystrophin magzati formája. Bíztató eredmények: SMT C1100-val, biglycan (szisztémás inj.). Utrophin gén bevitellel is próbálkoztak. • Myostatin gátlás ellenanyaggal (Myo-029), mivel aktiválódva az izomsejt-magban blokkolja az „izom-képző” géneket. Nem volt tartós a hatás. • Gyulladásos ágensek blokkolása (pl. szteroidok, Galectin-1, szulfaszalazin stb), • Antioxidánsok (koenzim Q10 származék: Idebenone, vagy a Protandim) a légzés, szívműködés javítására. • Orális glutamin supplementáció DMD-ben, fázis: II stádium, a vizsgálat helye: Poitiers, Franciaország. Csökkenti a teljes test protein degradációját.

10. I/a: génterápiaantisense oligonukleotiddal:PRO051-el, fázis I-II. (exon 51 ellen, helye: Leiden, Hollandia • 18 résztvevő (5-16 év közötti DMD-s fiúk) kapta subcutan (localis vizsgálat), egy karba, hetente 1x, 5 héten át (2008. 04.-2009. 02. között zajlott). Ezután izomerő és funkció mérés. Az „exon skipping” technika nem gyógyít, a DMD-t BMD-vé próbálják átalakítani, csökkenteni a tünetek súlyosságát. • Feltétel: PRO051-el (2’ o-metil-antiszenz oligoribonukleotid, kémiailag védet rövid RNS darabkák,) korrigálható mutáció jelenléte (előtte in vitro PRO051 screening módszerrel ellenőrzés). Eredményes volt: del 50, 52, 48-50, 49-50 esetén. A pre-mRNS-en belül csak ahhoz a szakaszhoz kötődnek, és sehova máshova, melyet el akarunk távolítani (a „splicing”-ot befolyásolják). • A Prosensa (holland cég) újabb antisense oligoi a következő exonokat távolítják el: 43, 44, 45, 46, 50, 52, és 53 (a kék színűek elsőbbséget élveznek kereskedelmi okokból).

11. I/b: génterápia antisense oligonukleotiddal: (AVI-4658, morpholino oligomer, exon 51 ellen), fázis I-II. (London) • Kilenc 14 év feletti DMD-s fiúnál próbálták, akik már tolókocsisok lettek, localisan (extensor digitorum brevis) (2006. 01.-2008. 01.-ig). Helye: Hammersmith Hospital, London (Cég háttér: AVI BioPharma Inc., Oregon). Szisztémás kezelést is terveznek. Del. exon 50 esetében: exon 49 vége l start exon 51 pro051: UC-UUU-ACG-GUA-GAA-GGA-ACU- CAG-CCA-GUG-AAGlCUC-CUA......UGG-UGA-CAC...AAC-UAG-AAA-UGC-CAU-CUU-CCU-UGA gln pro val lys l leu leu........trp stop Az exon 50 deletioját az exon 51 eltávolítása követi és a 49. exon végének a kodonja az 52. exon elejének komplett kodonjával folytatódik („in frame”): exon 49 vége l start exon 52 CAG-CCA-GUG-AAG l GCA-ACA-AUG-CAG-GAU-UUG- 77 aminosavval rövidebb a keletkezett gln pro val lys l ala thr met gln asp leu protein

12. I/c: génterápia PTC124-el DMD/BMD-s korai stop kodon mutációk esetén: fázis: IIb. • 165 fiún (Európából, É-Amerikából, Izráelből, Ausztráliából összegyűjtve) végzett vizsgálatok, akik 5 év felettiek, és 75 métert még tudnak gyalogolni. Cél: a stop codon átugrásával (reading through) dystrophin képzés beindítása szájon át bevehető tablettával (naponta 3x1, 48 hétig, vízben vagy tejben oldva). 6 hetente kiértékelés az izomfunkciót, izomerőt, aktivitást, járást és biztonságot illetően. • Elve: a betegek kb. 13-15%-ánál pontmutáció miatt stop kodon állítja le a fehérje szintézist (UGA, UAG, UAA, nonsense mutáció). A PTC124 (800 000-ből találta meg a PTC Therapeutics, New Jersey) a leolvasást ezen „átugratja”, a normál stop codont nem befolyásolja! Vér CK • Vizsgálati helyek: • Franciaország: Párizs, • Németország: Freiburg, Essen (2008. 02.-2010. 08.) • Olaszország: Róma • Egyesült Királyság: Newcastle University.

13. IV. DMD-s fiúk cardioprotektív terápiája • Béta blokkolók: Carvedilol versus Ramipril vizsgálata (2008-2011), Rómában. • Pentoxifylline, fázis I-II, Páviában, • SNT-MC17/idebenone (antioxidáns, 8-16 éves DMD-s fiúk esetén), Svájcban. • Perindopril ACE gátló hatása a DMD korai fázisában. Két éves, kettős vak, randomizált, placebo kontrollált vizsgálat. Helye: Franciaország, Hopital Necker, Párizs.

14. Génterápiára hívott betegeink: • H. L., dystrophin géndeletioja: del 45-50 (out-of frame, de del 45-51: in frame lenne!) • G. J., dystrophin géndeletioja: del 47-52 (out-of-frame, de 47-53: in frame lenne!) Sajnos egyikük sem érte meg ezt a lehetőséget!