Fyziologická podstata přezimování hmyzu aneb Jak zajistit přežití při poklesu tělní teploty

1. Fyziologická podstata přezimování hmyzu aneb Jak zajistit přežití při poklesu tělní teploty Vladimír Košťál Oddělení ekofyziologie Entomologický ústav Biologické centrum AV ČR České Budějovice kostal@entu.cas.cz

2. Kryobiologie hmyzu 1736 (Reaumur) první zmínky o schopnosti hmyzu přežít za podnulových teplot 1901 (Bachmetjev) podchlazení hmyzího organismu 1930 – 1975 (Salt) zakladatel oboru 1957 (Chino, Salt) hromadění glycerolu 1977, 78 (Duman) "anti-freeze proteins" a "protein ice nucleators" 1991 INSECTS AT LOW TEMPERATURE (1st edition) Eds. Richard E. Lee, David L. Denlinger Chapman and Hall, New York, 513 p. 2009 (?) INSECTS AT LOW TEMPERATURE (2nd edition) Definice oboru: Vědní obor, který se zabývá poškozujícími účinky nízkých teplot na hmyzí organismus a adaptivními a aklimatizačními změnami, které umožňují tomuto poškození předejít, tolerovat jej nebo jej napravit.

3. Definice nízkých teplot: Teploty pod prahem pro vývoj, růst a aktivitu organismu Rychlost procesu (vývoj, růst, ...) 100 % optimum 20 – 30 °C podchlazený stav promrzlý stav spodní teplotní práh Tělní teplota [°C] teplota krystalizace tělních tekutin bod podchlazení "supercoolingpoint" 0°C • Oblast nízkých teplot začíná pro různé druhy hmyzu • a v různých situacích za různých hodnot teploty: • tropické druhy: ca. 10 - 15°C • neaklimované temperátní druhy: ca. 5 - 15°C • aklimované temperátní a polární druhy: až -0.6°C

4. Strategie přežívání • Regulace • Migrace • Aktivita - tepelně pufrované prostředí • Podchlazení - udržet vodu v kapalném stavu • Promrznutí - dovolit regulovanou tvorbu ledových krystalů • Dehydratace – předejít mrznutí ztrátou vody • Rychlá chladová aklimace (RCH)

5. Aktivita • Larvální vývoj • brouka z čeledi Catopidae • (západní a střední Evropa), • probíhá v zimě, v opadance. • Imaga vstupují v létě do • aestivace a kladou na podzim. Catops Ceratophysella Boreus Chionea Triphleba • Imaga srpice Boreus a více druhů much se páří v zimě nad • sněhem, někdy jsou imaga bezkřídlá. • adaptivní výhodou přesunu aktivní fáze • do období nízkých teplot je patrně • využití volné niky • s nižším tlakem parazitů a predátorů a • s dostatkem potravy • Kolonie chvostokoků Ceratophysella sigillata migrují po sněhu • v lednu (Švýcarsko, 600 m n.m.), během migrace se rozmnožují, • živí se na nárůstech řas na odumřelém dřevě (v létě upadají do • dormantního stavu).

6. Podchlazení vs. Promrznutí • základní předpoklady: • mít malé rozměry vodních kompartmentů • zabránit heterogenní nukleaci ledu • základní předpoklady: • zajistit tvorbu ledu v extracelulárních prostorech • mít schopnost přežít dehydrataci buněk mimobuněčné tělní tekutiny rozp. látky buňky a "lumeny" Bod tání snížení teploty Bod podchlazení vytvoření ledových krystalků v tělních tekutinách vede k osmotickému odsávání vody z buněk a tím k jejich dehydrataci a smršťování

7. Podchlazení vs. Promrznutí • voda zůstává v kapalném stavu • voda v extracelulárních prostorech se mění na led • dochází k silné dehydrataci buněk • hrozí ztráty vody • voda je "konzervována" v ledových krystalech • led brání difůzi kyslíku, • anaerobní metabolismus buněk je minimální • až nulový = kryobióza • aerobní metabolismus se zpomaluje, • nikoli však zastavuje • jsou udržovány transmembránové • elektrochemické potenciály • transmembránové elektrochemické potenciály • zcela disipují • relativně aktivní metabolismus: • - vyžaduje přísun energie • - vyžaduje koordinaci • - je náchylný k poškození • metabolismus v hluboké supresi: • - umožňuje šetřit energií • - nevyžaduje koordinaci • - je odolný vůči poškození

8. Mechanismy přežití: Komplexnost aklimačních změn ENVIRONMENTAL FACTORS short days decreasing temperature perception cryoprotectants hormonal milieu chaperonins gene expression antioxidants protein activities anaerobic pathways developmental mode membrane lipids behaviour ice nucleators & AFPs metabolism ion homeostasis energy reserves water balance

9. Mechanismy přežití: Sezónnost, vstup do dormance (diapauzy) : central pacemaker biological clocks circadian oscillator molecular model CRY DBT SGG CK2 PDF fly CNS: Drosophila melanogaster

10. Mechanismy přežití: Prevence ztrát vody (především při podchlazení) Množství a složení kutikulárních lipidů bývá odlišné u nediapauzních a diapauzních stádií Snižuje se podíl osmoticky aktivní, tzv. "volné" vody kukly Pieris rapae crucivora (bělásek řepový) bílé sloupce: nediapauzní černé sloupce: diapauzní • akumulací hydrofilních polymerů • - glykogen (sval, tukové těleso) • - hexamerní proteiny (hemolymfa) • - LEA proteiny • akumulací osmolytů • - volné aminokyseliny (prolin) • - cukry (trehalóza, glukóza, ...) • - polyoly (glycerol, sorbitol, ...) Voda v hemolymfě slouží jako pufrační zásoba Může se vytvářet pufrační (?) zásoba vody v zadním střevě (rektum) Kaneko and Katagiri, 2004 Naturwissenschaften 91,320-323 • diapauzní kukly P. rapae mají několikrát silnější vrstvu • uhlovodíků na povrchu kutikuly: • nediapauzní kukly: tloušťka 11 nm • diapauzní kukly: tloušťka 195 nm • mění se i kvantitativní zastoupení jednotlivých uhlovodíků: • diapauzní kukly: 29:0  • 29:1  • 31:1  Metabolická suprese vede k zpomalení frekvence dýchání a tedy i k nižším respiračním ztrátám vody

11. Mechanismy přežití: Iontová homeostáza • hmyz, přezimující • v podchlazeném stavu • udržuje iontovou homeostázu Pyrrhocoris apterus Kostal et al., 2004 J. Exp. Biol. 207, 1509-1521 • chladová aklimace • tropického hmyzu vede také ke • zvýšení schopnosti udržovat • iontovou homeostázu Nauphoeta cinerea Kostal et al., 2006 Comp. Biochem. Physiol. B143, 171-179 • hmyz, přezimující v promrzlém stavu • rychle ztrácí elektrochemické potenciály, • ale je schopen opět je rychle generovat • po "roztání" Xylophagus cincta Kristiansen and Zachariassen, 2001 J. Insect Physiol. 47, 585-592

12. Mechanismy přežití: Metabolismus (aerobióza v podchlazeném stavu) • aerobní metabolismus podchlazeného hmyzu • je v hluboké supresi (diapauzou a teplotou), • ale stále funkční • vytvářená energie se spotřebovává patrně • především při generování transmembránových • potenciálů, popřípadě při biosyntéze a transportu • kryoprotektantů Glycogen GPase (a+b) NADPH NADP+ • nediapauzní (aktivní) jedinci: • glykolýza/-oxidace TCA  energie Glucose-1-P AR NADPH G6P-DH 6-P-Glucono- lactone Glucose-6-P Glucose diapauzní jedinci za nízkých teplot: Fructose-6-P Fructose • aktivizace glykogen fosforylázy za teplot • pod 5°C S O R B I T O L PDH NAD+ Ribulose Ribose PFK-1 • inhibice aktivity fosfofruktokinázy AR NADPH PDH NAD+ • zablokování toku uhlíku k TCA • aktivizace pentózového cyklu KR NADPH Fructose-1,6-bis-P R I B I T O L • vyšší aktivita glukózo-6P-dehydrogenázy • vyšší produkce NADPH CO2 NAD+ TCA cycle • vyšší aktivita aldózo reduktázy ATP • specifická aktivita ketózo reduktázy NADH • biosyntéza ribitolu a sorbitolu akumulace ribitolu a sorbitolu Pyrrhocoris apterus • zpomalení katabolické aktivity • polyol dehydrogenázy • při nedostatku NAD+ Kostal et al., 2004 J. Insect Physiol. 50, 303-313

13. conc.: 2.5  83.1 mmol.L-1 SCP: constant -18.0°C survival at -14°C/3 d: 13.3  41.5 % 2 uL diapause adult (pre-acclimated) 250 ug 500 ug Kostal et al., 2001 Comp. Biochem. Physiol. B130, 365-374 Mechanismy přežití: Biosyntéza a akumulace kryoprotektantů • vysoké koncentrace (> 1 mol.L-1) • - koligativní deprese bodu tání • - snížení bodu podchlazení • - oddálení promrznutí • nízké koncentrace ( ca. 0.1 mol.L-1) • - zanedbatelný koligativní efekt • - přesto zezónní průběh akumulace dobře koreluje • s chladovou odolností Ips acuminatus 1 mol = -1.86°K preferenční vytěsnění kryoprotektantů (disacharidy oranžově a prolin černě) z domény proteinu vede k preferenční hydrataci proteinu (N) a stabilizaci jeho funkční konformace hydratačním obalem Gekko and Timasheff, 1981 Biochemistry 20, 4667-4676 Gehrken, 1985 J. Insect Physiol. 31, 909-916

14. Mechanismy přežití: Syntéza "Antifreeze Proteins" (AFPs) • poprvé objeveny u antarktických ryb (DeVries, 1971) • později nalezeny rovněž u hmyzu (Duman, 1977) • v současnosti prokázány u ca. 50-ti druhů hmyzu, roztočů, pavouků a stonožek počítačová simulace funkce AFP I proteinu http://vidar.chemistry.duq.edu/faculty/ madura/research/index.html • funkční podstata spočívá patrně v nevazebné interakci (adsorpci) • repetitivních sekvencí proteinu na povrch ledového mikrokrystalu, • a tím v zabránění připojování se dalších molekul vody, •  oddálení krystalizace •  stabilizace metastabilního podchlazeného stavu Kristiansen and Zachariassen, 2001

15. Mechanismy přežití: Syntéza "Protein Ice Nucleators" (PINs) • poprvé objeveny u epifytických bakterií (Maki et al., 1974) • později nalezeny rovněž u hmyzu (Duman, 1978) LÉTOZIMA • funkční podstata spočívá patrně ve vytváření "matrice", • neboli katalytického povrchu, který je vhodný pro • uspořádávání molekul vody do krystalové mřížky ledu kooperativní agregace INAs zvyšuje nukleační aktivitu podchlazení zmrznutí intra-celulární a intra-luminární nukleátory sezónně syntetizované nukleátory v hemolymfě Zachariassen, 1980 J. Comp. Physiol. 140, 227-234 • druhy hmyzu, které spoléhají na strategii promrznutí, • je aktivně syntetizují a ukládají v hemolymfě • před příchodem chladného období • při poklesu teploty nehluboko pod 0°C promrzají scanning tunneling mikrofoto Yeung et al., 1991 J. Vac. Sci. Technol. B9, 1197-1201

16. Mechanismy přežití: Změny ve složení biologických membrán • membrány podchlazeného hmyzu musí zůstat ve funkční, "tekuté" fázi "tekutá" fáze desaturace mastných kyselin pokles teploty • vložení dvojné vazby (desaturace) • do řetězce mastné kyseliny vede ke • snížení teploty přechodu z tekuté do • gelové fáze membrány, která je • z takových molekul složena "gelová" fáze Drosophila melanogaster acclimated at: • změny v molekulárním složení • membrán jsou velmi komplexní • a dosud jen z menší části je • umíme adaptivně vysvětlovat Kostal et al., unpublished data

17. Mechanismy přežití: Změny ve složení biologických membrán • membrány promrzajícího hmyzu musí vydržet elastické šoky spojené s dehydratací • a musí odolat vzájemnému fůzování při těsném přiblížení po dehydrataci Crowe et al., 1987 Biochem. J. 242, 1-10 "water replacement" hypothesis Bryant et al., 2001 Seed Sci. Res. 11, 17-25 + trehalóza - trehalóza Chymomyza costata PL composition • membrány přecházejí do • fázového stavu gelu • a mohou vzájemně fůzovat • disacharidy udržují fázi membrán • tekutou a brání jejich fůzi Kostal et al., 2003 Comp. Biochem. Physiol. B135, 407-419

18. Mechanismy přežití: Integrovaná aktivace ochranných systémů • environmentální signály:délka dne  • příméfaktory prostředí:teplota , (kyslík ) • vývojové signály: hormony, mitogeny  • aberantní proteiny  • teplotní sensory • Hik33 (?) • sensory kyslíku • NADPH oxidáza • (?) • transkripční faktory: FoxO-P  FoxO HSF  trimerizace Rer  Rer-P HIF-1α + 1 dimerizace sinice • aktivace přepisu genů: p21   proliferace  antioxidanty (SOD, CAT)  šaperony (HSPs)  metallothioneiny  antimikrobiální proteiny  apoptóza  metabolické enzymy  p21   proliferace  šaperony (HSPs)  erythropoietin  VEGF  enzymy glykolýzy  (anaerobní) desaturázy MK  aktivita: metabolické enzymy  enzymy biosyntézy kryoprotektantů  savci

19. Závěry • Chladová odolnost hmyzu: • vynikající "výkony" (hluboké podchlazení, přežití promrznutí, přežití při -192°C, ...) • různé strategie (aktivita, podchlazení, promrznutí, ...) • minimálně dvoustupňová aklimatizace (změna vývojového programu  chladová aklimace) • četné mechanismy fungující jako komplex (kryoprotektanty, AFPs, PINs, membrány, ...) • integrace na molekulární a buněčné úrovni (evoluční konzervace principů) • aplikace (skladování a kryoprezervace, předpovědi mortality nebo změn areálů)

20. Oddělení ekofyziologie Entomologický ústav Biologické centrum AV ČR Branišovská 31, 370 05 České Budějovice kostal@entu.cas.cz 387 775 324 http://www.entu.cas.cz/kostal/