Glicogenosi tipo 1a: trasferibilità dei dati sperimentali al trattamento del paziente

1. Glicogenosi tipo 1a: trasferibilità dei dati sperimentali al trattamento del paziente AIG Rimini 2010 Luigi Varesio

2. Dal laboratorio alla clinca • Fase 1 • Sperimentazione in vitro e su modelli animali • preparazione dei reagenti per l’utilizzo sull’uomo • Fase 2 • Approvazione del protocollo dai comitati etici (Ospedale, Ministero della Sanità) • Certificazione dei reagenti per sperimentazione sull’uomo • Fase 3 • Sperimentazione della terapia sul paziente

3. Terapia cellulare GSD1a Trapianto di epatociti

6. Ben tollerate e poco invasive TERAPIA CELLULARE NEL FEGATO: STAMINALI Sperimentazione nel topo

7. Modello di topo Terapia con staminali della glicogenosi 1a fegato sano glicogenotico ˜ ˜ ˜ ˜ ˜ ˜ Cellule staminali ematopoietiche ˜ ˜ ˜ ˜ ˜ ˜ Iniezione nel fegato di cellule staminali derivate dal midollo osseo

8. c a b 20 mm 20 mm e d f g h 100 mm 2500 mm Ripopolazione del fegato con cellule staminali ematopoietiche ottenute da vari ceppi di topi topi Rosa-26 topi Rosa-26 topi Rosa-26 b-gal anti-b-gal controllo anti-b-gal a-GFP a-Alb Topi GFP Topi GFP Topi GFP Istochimica per attività G6Pasi FISH Fluorescenza GFP epatocita

9. Il trattamento con cellule staminali aumenta la sopravvivenza dei topi glicogenotici Non trattati Trattati v.t. Trattati i.f. Trattati i.e. % vivi Giorni dal trattamento

10. Trapianto di cellule ematopoietiche staminali CONCLUSIONI Cellule ematopoietiche staminali possono essere importanti per correggere i difetti enzimatici del fegato di pazienti con Glicogenosi di tipo 1a

12. I DIECI PRINCIPI DELLE GOOD MANUFACTURING PRACTICE LE NORMATIVE EUROPEE

13. Cell factory

14. LA GESTIONE DEL SISTEMA DI QUALITÀ • Il personale • -Le figure indispensabili:- Qualified Person- Responsabile Produzione-Responsabile Controllo Qualità • La documentazione* La gestione della documentazione* Le standard operating procedures* I protocolli • Il change control • Le deviazioni • Out of  specification e out of trend nei laboratori di controllo qualità • La gestione delle azioni correttive e preventive • I reclami ed i richiami • Le auto ispezioni • La certificazione dei lotti

15. LA PRODUZIONE • Descrivere i flussi dei materiali in conformità alle normative GMP • Descrivere i flussi di processo in conformità alle normative GMP • Gli ambienti e le apparecchiature • I sistemi di condizionamento • Le utilities* Acqua* Vapore* Gas* ecc… • La qualifica e le sue fasi • La convalida di processo • Il mantenimento dello stato di qualifica e convalida* Calibrazione* Manutenzione* Riqualifica

16. IL CONTROLLO QUALITÀ • Ruoli e competenze • Le attività di laboratorio* Metodi di analisi* La qualifica della strumentazione* La convalida dei metodi di analisi • lL campionamento • LE GESTIONE DELLE ATTIVITÀ A CONTRATTO • Il “Technical/Quality Agreement” • La qualifica del fornitore

17. La glicogenosi 1a può essere associata ad uno stato infiammatorio Necrotic foci, elevated chemokines and infiltrating neutrophils in the liver of glycogen storage disease type Ia. Kim DY et al, J Hepatol. 2008

18. Manifestazioni cliniche epatomegalia ipoglicemia iperuricemia iperlipidemia ritardi di crescita Complicazioni mancata crescita ritardo puberta’ gotta giovanile pancreatite arteriosclerosi epatoma ipertensione adenoma malattie renali zuccheri proteine G6Pase grassi Glicogenosi tipo 1a Infiammazione Che cosa causa l’infiammazione? Citochine IL-6, IL-8

19. No VHL normale No VHL normale No G6Pasi normale Il gene della sindrome Von Hippel Lindau (VHL)

20. pathologic physiologic Hypoxia causes inflammation • Years ago: • 3.8 billion first procariotic fossil • 2.0 billionphotosynthetic organisms • Oxygen captured by ferrous iron • Earth “rusted” • 1.8 billion first eucariotic organism • Hypoxic Atmosphere (1% oxygen) • 0.6 billion animal evolution • Normoxic Atmosphere ( 20% oxygen)

21. HIF-1 Pathway HYPOXIA NORMOXIA Prolyl- Hydroxylation Hydroxylation OH P HIF-1a P HIF-1a OH P P OH P HIF-1a OH P P P P P P P P HIF-1a HIF-1a HIF-1a HIF-1a HIF-1a HIF-1a HIF-1a HIF-1a pVHL P P P P P P P P P Ubiquitination Stabilization Stabilization OH P HIF-1a OH Ub Ub Ub Ub Ub P P P HIF-1a HIF-1a cofactors cofactors CBP/ p300 CBP/ p300 Proteosomal degradation P P HIF-1b HIF-1b HRE HRE HIF-1a Transcription Transcription x No VHL

22. Hypoxia in patho-physiological processes Growing tumors Myocardial ischemia Cerebral ischemia Energy metabolism Diabetic retinopathy Pulmonary hypertension Cell survival Angiogenesis HYPOXIA (pO2 0-20mm Hg) Rheumatoid arthritis Wound healing Erytropoiesis Cell migration Cell proliferation/ survival Aherosclerosis Microbial infections Preeclampsia Intrauterine growth retardation

23. Ipossia Glicogenosi 1a C’è ipossia nel fegato glicogenotico?

24. Il mondo dell’ “omica”

26. The chip 54000 probsets

27. PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA IN GSD1a Analisi tramite tecnologia microarray del: • Profilo di espressione genica nel fegato di TRE pazienti GSD1a trapiantati rispetto a TREsoggetti normali • Bibliosphere (Genomatics) nuovo programma per analizzare le vie metaboliche modificate nei tessuti

28. Ipossia nel fegato di pazienti con glicogenosi 1a la glicogenosi 1a causa ipossia del fegato

29. Hypoxic tissue Monocyte Monocyte trapping CXC-Chemokines ↑ Neutrophils recruitment CC-chemokine receptors ↓ Gro-chemokines ↑ Mn migration inhibiting factor (MIF) ↑ G-protein deactivator (RGS1) ↑ Circulation Motility-promoting factor (ENPP2) ↓ O2

30. Che cosa provoca queste risposte? L’IPOSSIA DEL FEGATO Necrotic foci, elevated chemokines and infiltrating neutrophils in the liver of glycogen storage disease type Ia. Kim DY et al, J Hepatol. 2008

31. Manifestazioni cliniche epatomegalia ipoglicemia iperuricemia iperlipidemia ritardi di crescita Complicazioni mancata crescita ritardo puberta’ gotta giovanile pancreatite arteriosclerosi epatoma ipertensione adenoma malattie renali zuccheri proteine G6Pase grassi Glicogenosi tipo 1a Infiammazione Che cosa causa l’infiammazione? L’IPOSSIA DEL FEGATO Citochine IL-6, IL-8

32. Quali sono le criticità? BIOBANCHE!! raccolta dei campioni e diffuione dei risultati

33. Dati clinici Raccolta tessuto Biobanca Raccolta , conservazione, Distribuzione tessuto Frazionament tessuto Derivati del Tessuto DNA, RNA, Proteine, distribuzione conservazione Arrays Datti: centinaia di migliaia “omics” Bioinformatica Integrazione BANCA DATI Biobanca Integrata Tessuto-genomica (BIT) Gaslini Pazienti Trattamento Classificazione Patologia Diagnosi Strutture DNA Espressione Genica RNA regolatori BIT • Ricerca: • Data mining • Biomarcatori • Vie Metaboliche • Clinica • Fattori Prognostici • Indicatori risposta

34. Biobanca Digitale Europea (DiBi) aggrega varie “BIT” Centralizzazione dell’informazione e nondei tessuti/sieri

35. Biologia Molecolare Gaslini R. Lavieri A. Eva P. Fardin R.Resaz L. Varesio National Institutes of Health (USA) J.Chou D. Munroe S.K. Arya Associazione Italiana Glicogenosi Collaboratori Reparti Clinici • Dr. M. Di Rocco • G.Gaslini Institute (Genova) • Dr. D. Melis • Federico II University (Napoli) • Dr. R.Parini • S.Gerardo Hospital (Monza) • Dr. S. Paci • S.Paolo Hospital (Milano) • Dr. E. Procopio • Meyer Hospital (Firenze) • Dr. C. Dionisi • Bambin Gesù Hospital (Roma) • IST Genova • O. Barbieri

36. Haematopoietic stem cells

37. Hematopoiesis in the red bone marrow