Danışman: Prof.Dr .Mahmut Baykan Hazırlayan:Arş.Gör. Dr.Özlem Ögüç Şanlı

2. Kandaki bakteriyel ve fungalDNA’ nın doğrudan tespiti için, multiplexreal-time PCR testi kullanan temel klinik bir çalışma Danışman:Prof.Dr.Mahmut Baykan Hazırlayan:Arş.Gör.Dr.ÖzlemÖgüç Şanlı

3. Sepsis; birçok sistemi tutan, hemodinamik değişikliklere yol açan; şok, organ fonksiyon bozukluğu ve organ yetmezliğine kadar gidebilen ölümcül bir infeksiyon hastalığıdır • Bakteremi; canlı bakterilerin dolaşımda bulunmasıdır, tanısı kültür pozitifliği ile konur

4. Bakteremive fungeminin hızlı tespiti bakteriyoloji laboratuvarınınen önemli görevlerinden birisidir • Mikrobiyolojik raporlandırma , tedavi yeterliliğine ek olarak sepsis anındaki tedavi stratejisinin başarısı için de hayati öneme sahiptir

5. Mikrobiyal raporlama mortalite ve morbidite üzerinde büyük bir etkiye sahiptir • Örneğin, Pseudomonasaeruginosave Staphylococcusaureuskaynaklı infeksiyonlariçin sepsisin hızlı ve somut tedavisi önerilmektedir

6. Geleneksel kan kültürü (KK) den elde edilen sonuçlar, şüpheli infeksiyonun başlangıcından itibaren 24-72 saat içerisinde genellikle tespit edilemezler, bu durum ampirik tedavinin başlanmasını gerektirir

7. Sepsis şüphesinin ilk 24 saati süresince, antibiyotik tedavisinin vakaların %10-60’ ında uygun olmadığı bildirilmektedir(yani ,seçilmiş antibiyotiklere dirençli bir veya daha fazla sayıda patojen tespit edilmiştir)

8. Uygun olmayan antibiyotik tedavisi, yoğun bakım ünitelerinde(YBÜ) ortaya çıkan antibiyotik direnci ile birlikte %10-45’lik bir mortalite oranıyla ve daha uzun hastane kalımıyla ilişkilendirilmiştir

9. Etken patojenlere yönelik olarak antibiyotik tedavisinin hedeflenmesi direnci azaltmada önemlidir • Ama, potansiyel patojenlerin tespiti için, daha hızlı ve duyarlı tanı koyucu araçlar daha doğru ve uygun antibiyotiğin seçimi için gereklidir

10. Erken şüphelenilen sepsisli hastaların kanında bakteriyel ve fungalDNA’ nın doğrudan belirlenmesi ve tespit edilmeye başlanması uygun antibiyotik tedaviyi belirleme şansını doğurmuştur • Bu durum ilaç maliyetlerinin düşmesine, daha kısa tedavi süresine,hastanede daha kısa süre kalmaya ve tüm direnç oranlarında azalmaya yol açabilir

11. Yoğun bakım ünitelerine kabul edilen hastaların kanındaki tüm infeksiyonların%90’ nına neden olan 20 en önemli bakteriyel ve fungaltürü kandan doğrudan tespit etmek için LİGHT CYCLER SeptiFast( LC-SF) testi geliştirilmiştir

12. Mevcut çalışma, günlük uygulamada geleneksel kan kültürü ile kıyaslanan bu multiplexreal-time PCR kitini kullanan ve kanlarında şüpheli infeksiyonla YBÜ’ ye kabul edilen hastalarla gerçekleştirilmiş prospektif ve gözleme dayalı bir çalışmadır

13. MATERYAL-METOD • Bu prospektif gözleme dayalı çalışma, 6 aylık bir sürede 30 yataklı bir YBÜ’ de gerçekleştirilmiştir • Ateşi (>38°C) veya hipotermisi (<36°C) olan bütün yetişkin hastalar uygun bulunmuş • Klinik veriler YBÜ’de gelişmiş ve tüm hastane kalımı süresince prospektif olarak toplanmıştır

14. KAN KÜLTÜRÜ • Kan örnekleri tek bir venden alınmış (her bir KK için 10 ml) • KK’leri yapılırken; aerobik ve anaerobik kan kültürü şişeleri (Bact/Alert,bioMerieux,MarcyI’Etoile,France) 37°C’de5 gün inkübe edilmiş, mantar kültürü için kullanılan mycosismedyum şişesi ise (BACTEC 9200, BD,Point-de-Claix,France) 37°C’de14 gün süreyle inkübeedilmiş

15. LC-SF Testi • LC-SF testi 3 basamakta gerçekleştirilmiştir; • ( i) mekanik liziz ve DNA ayrıştımasıyla birlikte numune hazırlanması; • ( ii) üç paralel reaksiyonda(Gram-pozitif bakteri, Gram-negatif bakteri ve mantarlar) hedef DNA’nın real-time PCR amplifikasyonu ve özel hibridizasyonproblarıylatesbitedilmesi • (iii) türlerin ve kontrollerin otomatize tanımlanması

16. LC-SF testiyle tespit edilen hedef numuneler Tablo 1’de gösterilmektedir • DNA hazırlanması için 1,5 ml tam kan kullanılmış • PCR ürünlerinin real-time tespiti LightCycler 2.0 aracı kullanılarak gerçekleştirilmiş • Numunelerin erime sıcaklığı ve kontroller, LC-SF tanımlama yazılımı kullanılarak analiz edilmiş, ve bir rapor düzenlenmiştir

18. İstatiksel Analiz • Veri analizleri için SPSS yazılımı (Windows için SPSS, versiyon 14.1; SPSS, Chi­cago, IL, ABD) kullanılmış • Pozitif KK sonuçlarına sahip hastalar ile negatif KK sonuçlarına sahip hastalar arasındaki demografik verileri karşılaştırmak için Mann–Whitney U-testi kullanılmıştır

19. SONUÇLAR • 72 hastadan peşpeşe alınan toplam 100 tane KK (aerobik, anaerobik ve fungi) ve LC-SF numuneleri incelenmiş • Negatif KK sonucuna sahip hastalar ile pozitif KK sonucuna sahip hastalar arasında YBÜ’nekabulu için sebepler veya demografik veriler bakımından anlamlı düzeyde istatistiksel farka rastlanmamıştır (p >0.05)

20. En çok şüphelenilen infeksiyonbölgesi solunum yollarıydı;negatif KK sonuçlarına sahip numunelerin %66’sı (59/90) ve pozitif KK sonuçlarına sahip numunelerin %70’inde (7/10)

21. Kanın alınışından LC-SF sonuçlarının elde edilişine kadar geçen süre 7 ile 15 saat arası değişiklik göstermiştir • Tablo 2, 100 tane eşleştirilmiş numuneye ait 102 tane sonucu göstermektedir • Altı hastada, KK tek başına pozitifmiş, Staphylococcusepidermidis kan alımında meydana gelen bir kontaminant olarak kabul edilmiştir

23. LC-SF ile belirlenen pozitif vakaların sonuçları Tablo 3’te verilmiştir • Sadece KK’lerinde görülen LC-SF testiyle belirlenemeyen iki tane maya mantarı vardı: Candidaglabrata/S. aureus (hasta 4) ve Candidaalbicans/Candidatropicalis (hasta 9). • İlk vakada, C. glabrata LC-SF testinden 5 gün önce boğaz ve idrardan elde edilmiş, ikinci vaka için, C. albicansLC-SF testinden 15 gün önce bronşiyal salgılardan izole edilmiştir

25. LC-SF’nin sonuçlarının KK’den elde edilenlerle karşılaştırılmasında, testin analitik performans parametreleri aşağıdaki gibi tespit edilmiş: duyarlılık, özgüllük, pozitif prediktif değeri (PPV) ve negatif prediktif değeri (NPV) sırasıyla %40, %88, %27 ve %93 şeklindeydi

26. Sekiz hastada, organizmalar LC-SF testi kullanılarak belirlenmiş, fakat bu hastaların KK sonuçları negatifti (Tablo 3) • LC-SF ve mikrobiyolojik verilerin sonuçları esas alındığında üç hastanın (hasta 2,3 ve 6) antibiyotiği değiştirilmiş • Bu hastaların iki tanesinde (hasta 3 ve 6) ilk tedavinin yetersiz olduğu düşünülmüştür

27. Antbiyotikalmayan 2. hasta LC-SF sonucunun (E. coli) pozitif olması yüzünden altıncı gün antibiyotik almaya başlamış • 5. hastada antibiyotik tedavisi yeterli olduğu düşünülmesine rağmen, kateterin enfeksiyon kaynağı olabileceği düşünülerek, LC-SF testinin ardından kateterçıkarılmış • Pozitif LC-SF sonuçlarına sahip dört hasta (hasta 1,4,7 ve 8) LC-SF testi döneminde zaten antibiyotik alıyorlardı ve antibiyotik rejiminde değişiklik yapılmamıştır

28. Tablo 3’de ilk tedavinin dört hasta için yetersiz olduğu ve antibiyotik rejiminin bu hastalar için değiştirildiği gösterilmektedir

29. 11 farklı vakadan (Tablo 3; dokuz tane LC-SF pozitif/KK negatif, iki tane LC-SF pozitif/KK farklı) on tanesinin gerçek-pozitif sonuçları olduğu kabul edilmiş,yani klinik bulgular ve diğer mikrobiyoloji sonuçlar pozitifmiş • Ayrıca, LC-SF sonuçları negatif fakat KK sonuçları pozitif olan iki numune sonuç olarak klinik bakımdan anlamlı bulunmamış (Tablo 2). Bundan dolayı, LC-SF performansı aşağıdaki gibi belirlendi: duyarlılık %78; özgüllük %99; PPV %93; NPV %95

30. TARTIŞMA • LC-SF testi önceden inkübasyona ihtiyaç duyulmadan doğrudan kanda mikroorganizmaları belirlemek için kullanılan ilk DNA bazlı testtir • Bunun gibi bir test, sepsisi olmasından şüphe edilen hastaların tedavisini optimize etme potansiyeline sahiptir

31. Mevcut çalışmada bakteremiden iyileşme oranı, LC-SF testiyle elde edilen sonuçlara göre yapılan tedaviyle, KK’den açık bir şekilde daha iyiymiş

32. Ancak, bu sonuçlar üç tane soruyu ortaya çıkarmıştır: (i) Sadece LC-SF testinde belirlenen izolatların klinik uygunluğu nedir; (ii) PCR tarafından bulunan DNA’ nemi gerçek infeksiyonuyansıtır mı; ve (iii) KK ve DNA-bazlı testler arasında bunun gibi bir karşılaştırma için en iyi tasarım nedir?

33. Subklinik bakteriyel infeksiyonlarasahip hastalarda bile kanda dolaşan bakteriyel DNA’nın varlığına dair literatürde hiçbir çalışma yoktur

34. Mevcut çalışma esas olarak KK setinin sayısıyla ilgili bazı kısıtlılıklara sahiptir • Aslında, KK’lerin duyarlılığı daha büyük miktarda kanın kültürlenmesi yoluyla arttırılırken, LC-SF testi sadece üç tane aynı zamanda toplanmış KK’den oluşan bir setle karşılaştırılmıştır

35. Ancak, bu gibi bir moleküler testin amacı, numune sayısını azaltırken muhtemel en iyi duyarlılığı elde etmeye çalışmaktır

36. Diğer bir özellik sirküle eden cansız bakteri ve fungilerin, mesela antimikrobiyallerininhibite ettiği bakterilerdeki veya fagositik hücrelerin içindeki DNA’ nınamplifikasyonudur • PCR-bazlı metotlar KK’den daha duyarlıdır

37. Aslında, bakterilerin sadece LC-SF testiyle belirlendiği 11 vakada sonuçların yanlış pozitif olduğu varsayılabilir • Ancak, bu vakalardaki klinik bulgular ve diğer veriler arasındaki ilişki, iyileştirilen bakterinin hastanın durumundan gerçekten sorumlu olduğunu düşündürmektedir

38. Bundan dolayı, gelecekte KK artık kan dolaşımı infeksiyonlarınınteşhisinde referans standart olmamalıdır • Bu konuyla ilgili yayınlar arasında, yakın geçmişte yapılan bir çalışma, yanlış-pozitif kan kültür şişelerinin otomatik sistemlerle belirlendiğinin ve bu şişelerde mikrobiyal DNA değerlendirmesini önerdiğinin altını çizmektedir

39. İyice anlaşılmıştır ki, uygun antibiyotik tedavisinin zamanında başlanmasının mortalite üzerinde önemli bir etkisi vardır • LC-SF testi klinikçilere daha önce mümkün olandan çok daha erken ve iyi kalitede bir terapötikyönetim fırsatı sağlamaktadır

40. Bu bir ön çalışma olduğu için, pozitif KK ve/veya LC-SF sonuçlarına sahip hastaların sayısı çok azdı • Ancak, vakaların bir kısmında tedavi rejimi, LC-SF sonuçlarına ve diğer mevcut klinik bilgilere göre değiştirilmiştir

41. LC-SF testinin klinik uygunluğu KK sonuçlarında olduğu gibi klinikçiler tarafından belirlenmiştir • Kontaminasyon ihtimali, otomatik real-time PCR gibi teknik gelişmelere bağlı olarak önemli oranda azalmıştır

42. Bununla birlikte, bu çalışmada bir vakada kontaminasyon görülmesine rağmen Louie ve ark. tarafından gerçekleştirilen çalışmada sekiz vakada kontaminasyon (S. epidermidis) bulunmuştur

43. Doktorların mikrobiyolojik sonucu numune alındığı gün elde etmesi infeksiyonlarıntedavisinde ileri bir adım olacaktır • LC-SF testi gibi PCR bazlı bir testten elde edilen bir sonuç tek başına değil klinik önemi mevcut klinik ve diğer laboratuvarverilerini dikkate alarak yorumlanmalıdır

44. Bu ön çalışmadan elde edilen sonuçlar LC-SF testinin klinik olarak sepsisi olmasından şüphe edilen hastaların optimal tedavi yönetiminde değerli bir tamamlayıcı araç olabileceğini öngörmektedir

45. Sepsisi olan hastalarda sebep olan etkenlerin geleneksel kültür-bazlı metotlara ilaveten , LC-SF testini kullanarak saptanmasının, klinik faydaları ve nihai sağlık- ekonomik alandaki faydalarını değerlendirmek için daha büyük, çok merkezli, randomize kontrollü çalışmalar gereklidir