Il Controllo Ufficiale del Seme Andrea Galli

1. Il Controllo Ufficiale del SemeAndrea Galli Istituto Sperimentale Italiano Lazzaro Spallanzani - Milano ISILS - Milano

2. Controllo Ufficiale del Seme • Aspetti biologici • Seminologia • Genetica Molecolare • Aspetti normativi • Legge 30/91 • DM 403/00 • DM 27.12.94 ISILS - Milano

3. Spermatozoo e… acrosoma ISILS - Milano

4. Parametri seminali • Qualita’ estrinseca • Concentrazione (Burker, Coulter-Counter) • Motilita’ (CASA) • Morfologia (CASA,PH, DIC) • Stato di membrana • Swelling Test (HOS) • Integrita’ di membrana plasmatica (FCM) • Reazione acrosomale (FCM) • Capacita’ fecondante (FIV, ZP) • Qualita’ intrinseca • Stato della cromatina (FCM) • Tracciabilita’ genetica ISILS - Milano

5. Un test seminale deve essere… • Oggettivo • Preciso • Basso CV intra ed inter campionario • Sensibile • Basso intervallo di confidenza al 95% fra replicazioni • Routinizzabile • Economico ISILS - Milano

6. CONCENTRAZIONECamera di Burker Conteggio delle singole cellule all’interno dei reticoli della cellula contaglobuli. ISILS - Milano

7. CONCENTRAZIONECoulter-Counter Variazione dell’impedenza elettrica al passare degli spermi fra due elettrodi posti fra un capillare con soluzione isosmotica ISILS - Milano

8. MOTILITA’Camera di Makler ISILS - Milano

9. MOTILITA’Sistema CASA Analisi automatica d’immagini applicata alla valutazione della cinetica degli spermatozoi ISILS - Milano

10. MOTILITA’ Sistema CASA ISILS - Milano

11. MOTILITA’ Sistema CASA E’ necessario settare adeguatamente lo strumento soprattutto in termini di numero di “frames” da acquisire ed analizzare ed in termini di valori soglia di velocita’ e linearita’ per la definizione della motilita’ progressiva. ISILS - Milano

12. MOTILITA’ Sistema CASA I principali errori analitici sono dovuti a: • eccessiva concentrazione degli spermatozoi • temperatura del campione inadeguata • Settaggio inadeguato ISILS - Milano

13. MOTILITA’Sistema CASA • Definizione delle tracce degli spermatozoi tramite definizione dell’oggetto “spermatozoo” in successivi frames ISILS - Milano

14. MOTILITA’Sistema CASA • Report analitico per i principali parametri • Concentrazione (non usato) • Motilita’ • Totale • Progressiva • Locale ISILS - Milano

15. MORFOLOGIASistema CASA Valutazione morfometrica della testa dello spermatozoo e valutazione dello stato dell’acrosoma ISILS - Milano

16. Morfologia (DIC) Fissazione in glutaraldeide e visualizzazione in microscopia con contrasto interferenziale a 1250 ingrandimenti. ISILS - Milano

17. HOS Viene valutata la funzionalita’ di membrana incubando gli spermatozoi in una soluzione iposmotica. • Membrana integra = code piu’ o meno rigonfie • Membrana alterata = code normali Soggettivita’ del giudizio in situazione borderline. ISILS - Milano

18. Citofluorimetria a flusso ISILS - Milano

19. Integrita’ di membranaCarbossifluorescina-Ioduro di propidio ISILS - Milano

20. FCM – Integrita’ di membrana Spermi Integri = 77% ISILS - Milano

21. Qualita’ del seme e fertilita’ ISILS - Milano

22. Qualita’ del seme e fertilita’ La notevole variabilita’ dei coefficienti di correlazione fra la qualita’ seminale e la fertilita’ e’ dovuta alla difficolta’ di una corretta stima della fertilita’. ISILS - Milano

23. Qualita’ del seme e fertilita’ r=0.75 P<0.001 CASA+SCSA+MI Utilizzo di indici complessi ISILS - Milano

24. Qualita’ del seme e fertilita’ Esiste una associazione asintotica fra fertilita’ e numero di spermi vitali(al momento della inseminazione) sopra un valore soglia (che cambia a seconda del livello di fertilita’ del riproduttore) la fertilita’ non aumenta. ISILS - Milano

25. Marcatori Genetici: Microsatelliti Sequenze non codificanti di DNA consistenti di un numero variabile di sequenze ripetute ognuna caratterizzata da un dato numero di basi identiche ripetute 2 pb < < 5 pb MICROSATELLITE ISILS - Milano

26. (ca)n ca ca ca gacctaatc taccgttaa ca ca gacctaatc taccgttaa ca ca ca ca Allele 1 gacctaatc taccgttaa ca ca ca ca ca gacctaatc taccgttaa Allele 2 Allele 3 ca ca ca ca ca ca gacctaatc taccgttaa Allele 4 Allele 5 Microsatelliti dinucleotide ripetuto Differenti numeri di ripetizioni producono frammenti di differente lunghezza ISILS - Milano

27. Estrazione del DNA ISILS - Milano

28. Template 20 ng DNA Taq Gold activaction: 95°C for 10’ 30 C y c l e s Denaturation 93 °C for 1’ Annealing 55 °C for 1’ Extension 72 °C for 1’ Final Extension: 72 °C for 5’ Amplificazione del DNA (PCR) ISILS - Milano

29. Separazione dei frammenti tramite Elettroforesi Immagine del Gel standard ROX FAM HEX TET ISILS - Milano

30. Controllo Ufficiale del SemeDDMM 403/00 e 27.12.94 • Verifica corretta autocertificazione (VCA) • Verifica corretta identificazione (VCI) ISILS - Milano

31. ISILS - Milano

32. ISILS - Milano

33. ISILS - Milano

34. Qualita’ del seme e Centri Tori Per un centro di produzione seme e’ importante sviluppare modelli e/o approcci che consentano di massimizzare la produzione di dosi di seme congelato. ISILS - Milano

35. Qualita’ del seme e fertilita’ Pur non esistendo modelli predittivi adeguati per stimare il livello di fertilita’ dalla qualita’ seminale, esistono approcci altrettanto utili per massimizzare la produzione di seme congelato presso un Centro Tori: IL CONTROLLO STATISTICO DI QUALITA’ ISILS - Milano

36. Carta di Controllo E’ possibile evidenziare se la misura della qualita’ di un lotto di seme congelato, determinata come Numero di Spermi Progressivamente Mobili, e’ all’interno o all’esterno dei limiti (inferiore e superiore) della variabilita’ casuale (quella sempre presente in tutti i processi produttivi). Se uno o piu’ punti cadono all’esterno di tali limiti andranno adottati opportuni provvedimenti. ISILS - Milano