PCR - REAZIONE a CATENA della POLIMERASI

1. DNA 1 PCR 1 x 109 PCR Primer a RNA 3’ 5’ Nuovo filamento 5’ 3’ DNA stampo DNA polimerasi Primer oligonucleotidico DNA polimerasi termostabile Nuovo filamento DNA stampo 3’ 5’ 3’ 5’ Primers a RNA Nuovo filamento 3’ 3’ 5’ 5’ PCR - REAZIONE a CATENA della POLIMERASI E’ “IL” mezzo per produrre in vitro grandi quantità di una specifica sequenza di DNA, partendo da DNA estremamente complesso. Il principio a cui si ispira la PCR è la replicazione del DNA: REPLICAZIONE

2.    DENATURAZIONE: Il DNA viene denaturato mediante riscaldamento in provetta a ~ 92-95°C Denaturazione (~ 95°C) Allungamento (~ 70°C)  ANNEALING: La miscela viene raffreddata fino a raggiungere la temperatura che garantisce la specifica ibridazione dei primers alle regioni dello stampo ad essi complementari Annealing (~ 60°C)   ALLUNGAMENTO: La temperatura della miscela viene portata a 68-72°C consentendo alla DNA polimerasi termostabile di sintetizzare il filamento complementare allo stampo a partire dall’innesco oligonucleotidico Le FASI della PCR

3. regione di interesse I°step III°step 5’ 3’ i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano complementarietà al primer 1 3’ 5’ i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano 5’ 3’ primer 1 primer 2 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 5’ i primers si estendono complementarietà al primer 2 i primers si estendono complementarietà al primer 1 5’ 3’ II°step complementarietà al primer 2 i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano 3’ 5’ Frammenti desiderati (quelli di lunghezza variabile non sono mostrati) i primers si estendono 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ E così via filamenti di lunghezza variabile filamenti di lunghezza omogenea PCR

4. Amplificazione esponenziale 4° ciclo 3° ciclo Frammento desiderato 2° ciclo 1° ciclo 35° ciclo DNA stampo Numero di copie di DNA contenenti il frammento desiderato 23 = 8 24 = 16 235 21 = 2 22 = 4 Numero di copie di DNA della corretta lunghezza contenenti il frammento desiderato 2 8 0 0 I primi 4 cicli della PCR in dettaglio

5.  Lunghezza: 16 bp o più  Una sequenza di 16 bp sarà statisticamente presente solo una volta ogni 416 bp (~ 4 miliardi di basi) corrispondenti circa alla grandezza del genoma umano.  T annealing ~ 2-5°C al di sotto della più bassa Tm dei due primers usati ~ Tm primer 1 Tm primer 2  Se la Ta dei due primers è molto diversa si possono verificare amplificazioni asimmetriche o a singolo filamento. La Tmdipende dalla lunghezza e dalla sequenza del primers Tm = 4(G+C)+2(A+T)°C  Assenza di sequenze ripetute invertite che possano far ripiegare il primers su se stesso o di sequenze complementari fra i primers che causano l’amplificazione di dimeri dei primers PROGETTAZIONE dei PRIMERS Caratteristiche di un buon primer:

6. rev for 3314 rev 842 425 GGACACGTATGCCACAGCCC TGCTAAATTTTCCAGCTAGGTAGCAGGACACGTATGCCACAGCCCTTAAAAGCATATCTGCACATGTCTT 1442 1461 5’- -3’ 2264 2281 CATGCATGATGCTCAAATGCCGCATTGTTGCGCTGTACGCACACATGTATGAATGCATGGCACGGATCAA GTTGCGCTGTACGCACAC 3’- -5’ GTGTGCGTACAGCGCAAC GGGTGGGACCTGGGCGCCCCCGCCGTGAGCGCCTACTGCTCCACCTGGGACGCCGGCAAGCCGTACTCG 1859 1876 5’- -3’ PROGETTAZIONE “COMPUTERIZZATA” dei PRIMERS Primer FOR Primability of Match = 100% Stability of Match = 82% Primer REV Primability of Match = 100% Stability of Match = 81% Primer REV Primability of Match = 71% Stability of Match = 44%

7. 5’ 5’ CTTTTGGCATAGACCACATGCCA TGTTACAAGTGTGGATGGATGCC Minimum stem size: Minimum 3’ overlap: 4 Open file Calculate ? Clear 2 Optimal annealing temperature is 56.7. 3’ end of oligo 1 pairs to positions 5 to 10 of itself. ...PROGETTAZIONE “COMPUTERIZZATA” dei PRIMERS Tm = 56.1 Tm = 58.6  GGCCAGTGAATTCAGCTCACGCCCCAAATATGCAGCTTCCAGTCCAGTTTCATCCGGCGCGCTGAAGATTTTTTAGAGCATGCTCTATTATGCAGCGTCCGTTGGAATGCTCTTTTTAACTCCGCGCGCGCTAAACTTGCGATTTTTTGGGCGCGGCGCTGATATTGGGCGTCTGTTGAAGATGCTCTTAAGTGGCCACAAGGGAGATGGGTCGGGCTAAGGTTTCATATCTTACAATATAAAGTTGAAGACGATTTGTGGCACCCAGGGGCGGGAGACGCATGCATGCAGCTGCATGATTGCACCAAGATCCGAAGAGTGGTTTATGGTTTGAGCTTAATTACTGCATGCATGCAACTTTTTGGTACAACTTTTGGCATAGACCACATGCCATCCCACCTCCCATGCTTTTCATTTTTACTTGTAAATTTGGATCTATTATATCTTTTGAATCAAAAGTTCAATTTATATTTCGTTTGCGTATTCTTGTCCCTTGTGTCGAGAGCTTTGAAACAAGCCCACTTTTGAATACGTTTTGACAAATTCTAAAAACTTAAGTGAGTTTCAACTGCTAAAACTTGATAGAATGAATGAAAAATTTAGCAAGTTTCAAAGACTAAAACTGAAACCCTAAGCCCTTAGCCCTAGATCCTAAGCCCTAAGCCGGAAGTCCTAAACCGTATGCCCCTAACA  Tm = 83.6

8. Mg2+ dNTP DNA a doppio filamento Stampo Oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti che fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio Primers Miscela equimolare di dATP, dTTP, dGTP, dCTP Deossiribonucleotidi trifosfati Tampone contenente cloruro di magnesio Lo ione Mg2+ è essenziale per il funzionamento dell’enzima Tradizionalmente viene usata la Taq polimerasi, enzima termostabile estratto dal batterio termofilo Thermus aquaticus Enzima COMPONENTI di una REAZIONE di PCR

9. Non utilizzare quantità eccessive di stampo, primers e/o dNTP al fine di evitare amplificazioni non specifiche. Dosare accuratamente la [Mg2+] in funzione della quantità di stampo, primers e dNTP utilizzata  Mg2+ è indispensabile al funzionamento della Taq polimerasi, ma è chelato da stampo, primers e dNTP. Se in eccesso causa una perdita di fedeltà da parte dell’enzima. Selezionare l’enzima più idoneo alle proprie necessità  Emivita alla temperatura di denaturazione Processività Capacità di correzione degli errori Taq, Pfu... I FATTORI CRITICI della PCR …nella miscela di reazione

10. I FATTORI CRITICI della PCR …nella programmazione  TEMPERATURA e TEMPO di DENATURAZIONE 91-97°C a seconda della complessità dello stampo 94°C 1’ 30 cicli di denaturazione di 1 min Emivita Taq polimerasi: 30 min a 95°C  TDEN › 95°C o N. cicli › 30 Diminuire il tempo di denaturazione/ciclo ~ ~ NUMERO di CICLI Dipende da [stampo]iniziale  TANN troppo bassa amplificazione aspecifica 3x105 molecole iniziali   TANN troppo alta amplificazione con bassa resa 25-30 cicli  TMELTING TANN 50 molecole iniziali o primers lunghi  40-45 cicli N.B. Dopo 30-35 cicli: - l’attività dell’enzima si riduce - primers e dNTP si esauriscono 72°C 1’ Quindi, se: TEMPERATURA e TEMPO di ANNEALING 60°C 30’’  Allungare il tempo di annealing TEMPERATURA e TEMPO di ALLUNGAMENTO TEMPERATURA: 68-72°C a seconda dell’enzima TEMPO: 1min / Kb di amplificato ALLUNGAMENTO FINALE di 7-10 min per completare la sintesi degli eventuali prodotti parziali

11. PCR CLASSICA TOUCHDOWN PCR  Den. iniziale 1 ciclo 94°C 3-5 min Den. iniziale 1 ciclo 94°C 3-5 min  Den. 30 sec 94°C Ann. 30 sec Tm(+5°C) -1°C/ciclo All. 1 min/Kb 72°C Den. 30 sec 94°C Ann. 30 sec Tm(-5°C) All. 1 min/Kb 72°C 30 cicli 10 cicli   Den. 30 sec 94°C Ann. 30 sec Tm(-5°C) All. 1 min/Kb 72°C All. finale 1 ciclo 7 min 72°C 20 cicli  Manteni-mento 4°C All. finale 1 ciclo 7 min 72°C Manteni-mento 4°C STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’

12. HOT START NESTED PRIMER PCR Procedura: Perché realizzare una PCR “hot start”?  L’amplificazione è realizzata con un set di primers Durante l’allestimento della reazione di PCR o durante il riscaldamento iniziale del campione si possono verificare situazioni di appaiamento non specifico fra primers e stampo. Fra 40 e 50°C la Taq polimerasiha un’efficiente attività polimerasica e può estendere i primers non correttamente appaiati.  Il prodotto è riamplificato con un set di primers interni ai precedenti Ia PCR 5’ 3’ 3’ 5’ La PCR “hot start” previene la formazione di questi prodotti non specifici in quanto un componente chiave della miscela di reazione (enzima o MgCl2) viene aggiunto dopo lo step di denaturazione iniziale. 3’ 5’ IIa PCR pr. nested pr. nested 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ NOVITA’: Enzimi “Hot start” Gocce di cera 5’ I prodotti non specifici amplificati nella Ia PCR non saranno amplificati nella IIa 3’ 3’ 5’ ...STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’

13. La Taq e altre polimerasi hanno un’attività trasferasi-terminale che conduce all’aggiunta di un singolo nucleotide all’estremità 3’ dei prodotti di PCR. In presenza dei 4 dNTPs è preferenzialmente aggiunto dA.   Siti di clonaggio multiplo 5’ A-3’ 3’-A 5’ I prodotti di PCR possono quindi essere agevolmente clonati in plasmidi aperti che contengono un deossitimidin nucleoside (dT) alle estremità 5’. CLONAGGIO dei PRODOTTI di PCR T T r

14. Produzione di sonde oligonucleotidiche Clonaggio e manipolazione dei geni PCR PCR PCR PCR PCR PCR PCR PCR PCR PCR Mutagenesi casuale o sito-specifica Tipizzazione dei geni e del DNA: -caratterizzazione di ricombinanti batterici -diagnosi cliniche -analisi di campioni biologici in medicina legale APPLICAZIONI della PCR

15. STRATEGIA Caso 1: Caso 2: Sequenza genica omologa nota o sequenza proteica nota Sequenza genica nota  Si disegna un primer degenerato Si disegna un primer specifico Primers degenerati Si amplifica il gene desiderato direttamente dal DNA genomico o dall’’RNA Presentano varie opzioni a certe posizioni della sequenza rendendo possibile l’annealing e l’amplificazione di sequenze omologhe da organismi differenti N.B. I primers possono essere disegnati in maniera tale da contenere al 5’ la sequenza di specifici siti di restrizione che possono essere sfruttati per l’inserimento dei prodotti di PCR nei vettori di clonaggio. R = A, G H = A, C, T Y = C, T B = C, G, T W = A,T V = A, C, G M = A,C D = A, G, T K = G, T N o I= A, C, G, T S = C, G 5’-TCGAATTCNCCYAAYTGNCC-3’ EcoRI CLONAGGIO e MANIPOLAZIONE di GENI

16. mRNA Trascrittasi inversa + GSP1 II° gruppo di amplificazioni Sintesi primo filamento cDNA GSP2 Aggiunta coda omopolimera al primo filamento cDNA Trasferasi terminale + dATP 3’-AAAAAAAAA 5’ Sintesi secondo filamento cDNA GSP1 GSP1 GSP1 GSP1 GSP1 GSP1 5’ GSP2’ complementarietà al primer 3’ P P P’ P’ P P P P’ P GSP2 5’ I° gruppo di amplificazioni 3’ TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT P 3’-AAAAAAAAA 5’ TTTT 7-mG 7-mG AAAAA-3’ AAAAA-3’ 5’ Prodotto PCR finale GSP1’ 3’ 3’ 5’ GSP1 AAAAA AAAAA AAAAA complementarietà al primer P(dT) 5’ 5’ 3’ 3’ GSP1’ GSP1’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ - RACE Rapid Amplification Complementary Ends

17. mRNA Trascrittasi inversa + P(dT) Sintesi primo filamento cDNA GSP2 Sintesi secondo filamento cDNA 3’ 5’ P P TTTTT TTTTT GSP1 GSP1 GSP1 I° gruppo di amplificazioni complementarietà al primer GSP2 5’ 7-mG 7-mG AAAAAAAA-3’ AAAAAAAA-3’ AAAAA AAAAA AAAAA P’ P’ P’ 3’ 3’ 3’ 3’ P P P P TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT 5’ GSP1 GSP1 II° gruppo di amplificazioni 3’ 5’ 5’ complementarietà al primer P(dT) 3’ 5’ 5’ GSP1’ GSP1’ Prodotto PCR finale GSP2’ 3’ - RACE Rapid Amplification Complementary Ends

18.  ER OR PRONE PCR ~ PREMESSA: La frequenza di errore delle DNA polimerasi è allo 0,001 ‰ (una base ogni 106 nucleotidi) grazie ad un’attività corretrice 3’ 5’ che rimuove i nucleotidi male incorporati. MUTAGENESI CASUALE ? In che modo delle mutazioni nel gene influenzano la funzione del prodotto?  R E’ possibile indurre l’aumento di errori nella PCR utilizzando: Taq polimerasi prive di attività correttrice Basse temperature di annealing che diminuiscono la fedeltà Ineguali concentrazioni dei dNTP Elevate concentrazioni di MgCl2 Alto numero di cicli (60-80) Amplificazioni successive del prodotto di PCR      

19. LEGENDA sequenza bersaglio primer con differenza di un solo nucleotide nucleotide originale 1 4 nucleotide cambiato PCR 2 PCR 3 Filamento 4 Filamento 1 Filamento 3 Filamento 2 Denaturazione, rinaturazione Filamento 1 Filamento 4 Filamento 2 Filamento 3 MUTAGENESI SITO-SPECIFICA DNA lineare amplificato DNA plasmidico circolare con incisure e nucleotide cambiato Trasformazione di E. coli

20. Amplificazione sequenza bersaglio + quantificazione dell’espressione genica identificazione del prodotto di amplificazione specifico rispetto a prodotti aspecifici analisi simultanea di due campioni nella stessa reazione individuazione di mutazioni puntiformi … on-line e in tempo reale!     REAL-TIME PCR

21. Caratteristiche:  Rapide variazioni di temperatura durante i cicli termici  Come mezzo di trasmissione della temperatura dalla resistenza ai campioni viene utilizzata l’aria che, essendo virtualmente senza massa, rende questo processo molto veloce. Le reazioni vengono preparate in capillari di vetro borosilicato che, avendo un alto rapporto superficie:volume, assicurano una rapida equilibrazione fra l’aria ed i componenti della reazione. Una reazione di PCR di 30-40 cilci può essere completata in 20-30 min.  Monitoraggio on-line e simultaneo dell’amplificazione dei vari campioni mediante sistemi di rilevamento della fluorescenza LigthCycler SYSTEM Roche

22. L’unità ottica è dotata di un LED come sorgente di luce e di tre canali di rilevamento che misurano la luce emessa a tre differenti lunghezze d’onda: 530nm 640nm 710nm resistenza capillari (max 32) I valori di fluorescenza rilevati vengono visualizzati sullo schermo del computer consentendo il monitoraggio on-line della reazione di PCR. camera termica ventilatore L’intensità del segnale prodotto dal fluoroforo è proporzionale alla quantità del prodotto di PCR. filtri LED canali di rilevamento fluorimetrico Fluorescenza L’aumento dell’intensità del segnale inizia a cicli differenti a seconda della concentrazione iniziale del DNA bersaglio. Numero di cicli ...LigthCycler SYSTEM

23. E’ un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed emette la fluorescenza solamente in queste condizioni. DENATURAZIONE Non viene rilevata fluorescenza ANNEALING L’intensità della fluorescenza comincia ad aumentare SYBR Green Primer Luce emessa ALLUNGAMENTO L’intensità della fluorescenza continua ad aumentare e diventa massima al termine della fase di allungamento Polimerasi L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’ REGISTRATO A 530nm SYBR Green

24. SONDE di IBRIDAZIONE Due sonde oligonucleotidiche sequenza-specifiche, marcate con coloranti diversi, ibridizzano con la sequenza bersaglio sul filamento di DNA amplificato in un arrangiamento testa-coda che consente l’emissione della fluorescenza. Oligo 1 Fluoresceina Oligo 2 LC Red 640 Prodotto di amplificazione Colorante accettore Trasferimento Colorante donatore DENATURAZIONE Non viene rilevata fluorescenza: il colorante donatore è eccitato dalla sorgente ed emette energia in grado di eccitare l’accettore solo se la distanza fra i due è pari a 1-5 nucleotidi Eccitazione Emissione 1-5 nucleotidi ANNEALING Viene registrata la massima fluorescenza L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’ REGISTRATO A 640nm

25. Consente di identificare il prodotto di amplificazione specifico rispetto a prodotti aspecifici. Curva di fluorescenza Curva di melting 100 80 60 40 20 0 104 copie 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 104 copie 10 copie 0 copie 10 copie 0 copie Fluorescenza Fluorescenza 65 70 75 80 85 90 95 0 10 20 30 40 50 Temperatura (°C) Cicli di amplificazione 100 80 60 40 20 0 Derivata negativa della curva di melting Al termine della PCR la temperatura viene lentamente aumentata inducendo un decremento della fluorescenza. La temperatura in corrispondenza della quale si ha un repentino decremento della fluorescenza corrisponde alla Tm del prodotto. 104 copie 10 copie 0 copie prodotti non specifici -dF/dT TM 65 70 75 80 85 90 95 Temperatura (°C) ANALISI della CURVA di MELTING

26. Identificando il primo ciclo della PCR in corrispondenza del quale inizia l’amplificazione esponenziale del prodotto è possibile quantificare la concentrazione iniziale del DNA bersaglio. Estrapolazione della curva standard Curva di fluorescenza di campioni a concentrazione nota 105 106 104 copie Fluorescenza 105 106 104 copie linea di base La linea di base identifica il ciclo in corrispondenza del quale inizia l’aumento esponenziale della fluorescenza per ciascun campione. Numero cicli Riportando in grafico il valore di intersezione con la linea di base in funzione del Log della concentrazione iniziale di ciascun campione si ottiene la curva standard da cui si può estrapolare il valore della concentrazione di campioni a titolo ignoto. N. cicli Log concentrazione QUANTIFICAZIONE del PRODOTTO di PCR

27. Consente l’analisi simultanea di due campioni nella stessa reazione STRATEGIA: Due coppie di Sonde di Ibridazione, ciascuna specifica per un prodotto di amplificazione, vengono marcate con un diverso colorante accettore che emette la fluorescenza a differenti lunghezze d’onda. LC Red 640 LC Red 705 Fluorecseina Fluorecseina Canale 2 640 nm Canale 3 705 nm Il segnale emesso viene letto simultaneamente attraverso due canali di rilevamento fluorimetrico. Trasferimento Eccitazione Emissione MULTIPLEX PCR

28. Sfrutta differenze nella Tm di Sonde di Ibridazione perfettamente legate al DNA bersaglio o il cui legame è destabilizzato dalla presenza di basi non appaiate. gene selvatico omozigote wildtype Sonda 2 marcata con LC Red 640 Sonda 1 marcata con Fluoresceina 3.0 2.5 2.0 1.5 omozigote mutante eterozigote Fluorescenza gene mutato La Sonda 1 si ibridizza alla parte della sequenza bersaglio mutata La Sonda 2 si ibridizza alla parte della sequenza bersaglio non mutata 50 55 60 65 70 75 80 Temperatura 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 -0.05 -dF/dT Al termine della PCR si analizza la curva di melting: se è presente una mutazione, la Tm dell’ibrido sarà più bassa che in assenza di mutazione. 50 55 60 65 70 75 80 Temperatura ANALISI di MUTAZIONI PUNTIFORMI

29. REGOLAMENTO 258/97 sui Novel Food Disciplina la vendita di prodotti contenenti OGM destinati al consumo umano ed introduce la nozione di sostanziale equivalenza : due alimenti sono considerati sostanzialmente equivalenti quando non presentano alcuna differenza dal punto di vista nutrizionale, organolettico e della sicurezza. Rende inoltre obbligatoria l’etichettatura degli alimenti transgenici che non siano sostanzialmente equivalenti ai prodotti convenzionali. REGOLAMENTI COMUNITARI 49 E 50/2000 Prevedono l’obbligo di etichettatura per tutti gli alimenti che contengano ingredienti (49/2000), additivi e aromi (50/2000) derivanti da organismi geneticamente modificati. L’obbligo non vale se il prodotto risulti accidentalmente contaminato da derivati di organismi geneticamente modificati in una percentuale non superiore all’1%. L’ETICHETTATURA nei REGOLAMENTI C.E.E.

30. TEST sulle PROTEINE TEST sul DNA   Rilevazione immunologica della proteina codificata dal transgene (ELISA) Ricerca del transgene e di sequenze ad esso correlate (Real-time PCR) - Quali- / quantitativo - Rapido - Sensibile (limite = 0.0001%) - Quali- / quantitativo - Rapido - Test da campo  - Richiede materie prime non lavorate - Degradazione del DNA - Presenza di inibitori della polimerasi  - L’espressione delle proteine è spesso tessuto-specifica e sviluppo-dipendente - Possibili contaminazioni con DNA estraneo - Non tutti i derivati alimentari contengono DNA (es. olio di semi di mais) DIAGNOSTICA degli OGM negli ALIMENTI

31. I° STEP Analisi qualitativa (screening) Rivela la presenza/assenza dell’OGM nel campione Si ricerca la presenza di sequenze regolatrici comuni alla maggior parte degli OGM risultato negativo risultato positivo Si identifica il transgene presente, verificando se è uno di quelli autorizzati in commercio L’analisi si arresta II° STEP Nessun transgene autorizzato Analisi quantitativa Transgene autorizzato Se i singoli ingredienti superano la percentuale dell’1% scatta l’obbligo di riportarne la presenza in etichetta Alimento illegale ITER per il RILEVAMENTO di OGM negli alimenti mediante TEST sul DNA

32. Elementi caratteristici dei costrutti ricombinanti Promotore CaMV 35S Promotore CaMV 35S Gene marcatore Gene marcatore Transgene tNOS tNOS Amplificazione di una delle seguenti sequenze:  PCR QUALITATIVA Amplificazione di geni sicuramente presenti nel campione (es. lectina della soia, zeina del mais)  (è disponibile una banca dati che contiene tutte le sequenze di DNA depositate nei brevetti a livello mondiale) PCR QUANTITATIVA GENI BERSAGLIO nell’analisi qualitativa degli alimenti Individuazione del transgene

33. Mais Bt Soia Roundup Ready Il mais-BT è stato reso resistente alla piralide mediante l’inserimento La soia Roundup Ready (Monsanto) è stata modoficata geneticamente per resistere alla somministrazione del glifosato, un diserbante ad ampio spettro. di un gene che codifica per una tossina insetticida derivata dal batterio Bacillus turingiensis la cui ingestione provoca la morte delle larve paralizzandone l’intestino. Per quantificare mais e soia transgenici negli alimenti sono state opportunamente disegnate combinazioni di Sonde di Ibridazione che riconoscono tanto il transgene quanto un gene endogeno, rendendo possibile quantificare simultaneamente sia il contenuto di mais/soia GM che di mais/soia totale nel campione in analisi. Sonda 1 specifica per il transgene cryIA(b), codificante per la tossina Sonda 1 specifica per il transgene CP4-EPSPS Sonda 2 specifica per il gene endogeno codificante per l’enzima invertasi Sonda 2 specifica per il gene endogeno codificante per la lectina 2 ESEMPI di QUANTIFICAZIONE...