Becaria: Bioq . María Andrea Delgado Directora: Dra . Carla Gabriela Asteggiano

1. Becaria: Bioq. María Andrea Delgado Directora: Dra. Carla Gabriela Asteggiano Centro de Estudio de las Metabolopatías Congénitas (CEMECO), Cátedra de Clínica Pediátrica, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba, Hospital de Niños de la Santísima Trinidad, Córdoba. Progresión del Primer Programa Argentino de Reconocimiento y Caracterización de los Graves Defectos Genéticos de la Glicosilación Proteica: Desarrollo metodológico para el estudio de defectos de O-Glicosilación de proteínas

2. Importancia de las glicoproteínas • 50% son glicoproteínas • proteínas de membrana • receptores • extracelulares • intracelulares • Las glicoproteínas juegan un papel esencial en modular: • Correcto plegamiento • Estabilidad • Interacción con otras proteínas implicadas: reconocimiento, migración y • diferenciación celular • Adhesión celular • Mecanismos de defensa y antigenicidad

3. Diferentes clases de glicoconjugados O-glicanos C-glicanos N-glicanos THR/SER AnclajesGPI GAGs Glicolípidos citoplasmáticos y nucleares O-glicosilación Glucosa Manosa N-acetilglucosamina ASN N-glicosilación N-acetilgalactosamina

4. Objetivos generales • Continuar con el desarrollo de los diferentes aspectos (clínicos, bioquímicos y moleculares) para el diagnóstico y la investigación de los Desórdenes Congénitos de la Glicosilación de proteínas, referida específicamente a las alteraciones de la O-glicosilación, en un grupo interdisciplinario de investigación clínica, a fin de contribuir en un capítulo inédito en el estudio de las metabolopatías en nuestro país

5. Objetivos específicos A) Continuar con el análisis de los perfiles de isoelectroenfocado (IEF) y Western blot de transferrina y haptoglobina (N-glicosilación) en pacientes con sospecha de defectos N-glicosilación B) Estandarizar e implementar ambas metodologías en la proteína Apolipoproteína C III (apo CIII) para el estudio de O-glicanos tipo Mucina, en pacientes con sospecha de defectos O-glicosilación o combinados de N-y O-glicosilación C) Desarrollar un protocolo de investigación (bioquímico y molecular) para el estudio de alteraciones de la O-glicosilación debidas a defectos en la biosíntesis de los GAGs (glicosaminoglicanos) responsables del Síndrome Clínico de Exostosis Múltiple Hereditaria D) Protocolizar la búsqueda de nuevas alteraciones combinadas de N- y O-glicosilación proteica en pacientes que presenten un patrón de IEF no identificado (CDG-X) E) Difundir en la comunidad científica los avances obtenidos

6. Metodología para continuar con el estudio de pacientes con sospecha de defectos N-glicosilación (Objetivo A) • 1-Material: muestras de sangre de 250 pacientes • 2- Análisis cuantitativo y cualitativo de glicoproteínas séricas: eldiagnóstico de CDG está basado en cambios bioquímicos y estructurales que se expresan en glicoproteínas anómalas, analizadas por Western blot o Isoelectroenfocado (IEF)

7. Patrones de IEF y western blot Isoelectroenfcado • Patrón Tipo I (CDG-I): decrecimiento de la tetrasialotransferrina e incremento de di- y asialotransferrina • Patrón Tipo II (CGD-II ): incremento de tri- y monosialotransferrina Tf Hp CDG Ia +N CN +N P2 +N P3 +N CN CDG II CDG Ia CDG II p5 ApoCIII Western blot

8. Avances obtenidos: objetivo A Continuación de los estudios en pacientes con sospecha de alteraciones de la glicosilación proteica • a) En los pacientes con perfil CDG Tipo I (n:2): Se analizaron las actividades enzimáticas más frecuentes NORMAL Se estudiaron los genes para CDG-Ia, Ib y IhNORMAL Se confirmó CDG-I mediante EC y MS Para determinar el defecto molecular se enviaron biopsias de piel (Bélgica), para estudios de LLOs (lipid- linkedoligosaccharides) Resultados en progresión • b) Pacientes con patrones de IEF-Tf CDG Tipo II (n:8): análisis por MS (massespectrometry) que permitirá identificar la estructura de los glicanos liberados de la N-glicoproteina en estudio. (Dra. Sturiale (Catania, Italia). Resultados en progresión. • c) Pacientes con desplazamiento aniónico (aumento de isoformas superiores de transferrina) (n:12) : se debió a polimorfismos proteicos de la población Argentina (comprobados por digestión con Neuraminidasa y electroforesis capilar).

9. 2222.8 25000 70000 80000 85000 90000 75000 70000 75000 80000 85000 90000 Mass (m/z) Mass (m/z) 20000 15000 Counts 10000 1931.7 2369.1 5000 2589.6 2078.0 2245.2 2572.5 3025.7 0 1500 2000 2500 3000 3500 Mass (m/z) Isoelectroenfoque de Transferrina Análisis por Espectrometría de Masa 2 Gly 2Gly Control Paciente 4 1Gly 0 Gly MALDI-TOF Acidic N-linked glycans from serum Tf CDG Ia P1 CN P4 Isoformas de Transferrina Paciente 4 Control Normal Paciente 4 Cuantificación densitométrica Paciente 4 Resultados

10. Protocolo de investigación para alteraciones de la O-glicosilación responsables de Exostosis Múltiple Hereditaria (Objetivo C) Exostosis Múltiple Hereditaria, Osteocondromatosis Múltiple, patología ósea ocasionada por alteración de O-glicosilación proteica debida a defectos en la biosíntesis de proteoglicanos unidos al Heparán sulfato (HSPG) • Herencia: autosómica dominante • Frecuencia: 1:50.000(población general s/ Boveé JVMG, 2008)

11. Osteocondroma • Proyección en la cubierta de los huesos conteniendo una cavidad de médula continua con la del hueso subyacente • Tumores benignos • Son pedunculares o sésiles, pueden variar de tamaño

12. Aspectos clínicos • Criterio diagnóstico: Radiológico: presencia de osteocondromas en la región juxta-epifiseal de huesos largos,siendo necesario diferenciarla de otras patologías óseas: condrosarcoma, displasia epifisiariahemimélica, osteoma y condroma del periostio • Presentación: Ocurren como Osteocondromas Múltiples (OM) (15%) con historia familiar positiva en diferentes generaciones y/o Osteocondromas Solitarios (OS) o esporádicos, localizados de manera única y sin antecedentes familiares (6 veces más comunes) • Tratamiento: Cirugía: cuando hay dolor, disturbios en crecimiento, deformidad angular, disminución de la movilidad, artritis degenerativa, presión vascular y nerviosa • Complicación más importante: transformación maligna de osteocondroma a condrosarcoma (0,5% a 5% de pacientes).

14. Etiología: alteración en biosíntesis de Heparán Sulfato (HS) • Es un Glicosaminoglicano (GAG), distribuido en la superficie extracelular de la mayoría de tejidos • Está unido a varias proteínas formando proteoglicanos (PG) • Proteoglicanos unidos al heparán sulfato (HSPGs): intervienen en muchos mecanismos de señalización intracelular, morfogénesis e interacciones célula-célula

15. Biosíntesis de Heparán Sulfato • Familia de genes: EXT1, EXT2, EXTL1, EXTL2 y EXTL3 codifican glicosiltransferasas en humanos, con actividad supresora de tumores • Productos génicos: Exostosinas 1 y 2, glicosiltransferasas del Aparato de Golgi, involucradas en la síntesis y elongación del heparánsulfato • La alteración de las proteínas EXT afecta la señal de síntesis de Proteoglicanos unidos al Heparán sulfato (HSPGs), desregulando la proliferación de condrocitos y posibilitando la formación del exostoma Iniciación Polimerización Adhesión de GlcNAc HSPG Tetrasacárido Disacáridos repetidos O-Glicosilación

16. Aspectos genéticos Mutaciones tanto en EXT1 y EXT2: fenotipo clínico de EMH indistinguible.

17. GEN: EXT1 • 312 kb • 746 aminoácidos • 2238 bases GEN: EXT2 • 150 kb • 718 aminoácidos • 2154 bases

18. Consentimiento informado PedigreeReclutamiento de familiares Protocolo de investigación Genotipo Fenotipo • Extracción de ADN de todos los integrantes de la familia (12 familias) Clínico Radiográfico • Ubicación y recuento de lesiones • Alineamiento de miembros • Longitud de miembros • Peso (percentil) • Talla • Movilidad • Calidad de lesiones • Alineamiento de miembros • -s/ Alvarez y col, 2006 • Francannety col. 2001 Secuenciamiento de ADN • Amplificación de EXT1 y EXT2 • Secuenciacióndirecta • Identificación de las mutaciones • Confirmación de la mutación Definición genotípica Definición fenotípica Análisis correlación genotipo- fenotipo Primario: genotipo vs fenotipo Secundario: género vs fenotipo, edad vs fenotipo

19. Avances Obtenidos (Objetivo C) • Paciente 1 (PN): OM, con malignización del osteocondroma a condrosarcoma. Mutación en el exón 1 del gen EXT1, (c.848 T>A) aún no descrita, produce un cambio de aminoácido (p.L283X) que codifica un codón de stop prematuro proteína trunca con pérdida funcional. • Paciente 2 (CZ): OM. Mutación en exón 2 del gen EXT1 (c.1037 G>C) aún no descrita, produce un cambio de aminoácido (p.A283T) en etapas tempranas del transcripto. • Paciente 3 (VF), OM, sin antecedentes familiares. Deleción puntual en el exón 6 del gen EXT1 (c.1469 delT), produce corrimiento del marco de lectura y un stop prematuro. Descrito como un síndrome de genes contiguos: Langer−Giedion en una región del cromosoma 8q24.1(2).

20. Curso futuro de la investigación • Se continuarán con el análisis de los 9 pacientes restantes durante la segunda etapa de la beca. • Se espera consolidar un grupo multidisciplinario y multicéntrico para la Investigación clínica, bioquímica y molecular, de pacientes con Exostosis Múltiple Hereditaria en nuestro país. • Actualmente participan del proyecto: • CEMECO (Centro de Estudio de las Metabolopatías Congénitas) • Comité de Tumores Músculo esqueléticos de la Provincia de Córdoba • Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Barcelona, España. • Importancia de estudio: Conocer la variabilidad en la presentación fenotípica y la evolución de la enfermedad, especialmente en pacientes que presenten transformación maligna de OM a CS • Profundizar en las bases moleculares de este conjunto de enfermedades debida a Defectos Congénitos de la Glicosilación Proteica .

21. Directora CEMECO: Prof. Dra. Raquel Dodelson de Kremer Investigadora Responsable CDG: Dra. Carla Asteggiano Estudio de alteraciones de N-glicosilación y O-glicosilaciónProteica: Mag. Nydia Azar Dr. Norberto Guelbert Bioq M. Beatriz Bistué Millón Dra. Adriana Becerra Bioq. Andrea Delgado Servicio de Bioimágenes: Dr. Hector Hugo Robledo Tesinista Mauricio Di Rienzo Servicio deTraumatología: Dra. Lorena Zecchini “CongenitalDisorder of Glycosylation” Proyecto subsidiado por CONICET, FONCyT, Ministerio de Salud de la Nación y Universidad Católica de Córdoba.