Biotechnológie

1. Biotechnológie Ján Turňa turna@fns.uniba.sk Katedra molekulárnej biológie dmb.fns.uniba.sk Prírodovedecká fakulta Univerzita Komenského Bratislava

2. Predaj biotechnologických produktov vyrobených fermentačne s využitím rDNA • Najrýchlejšie rastúci trh • Objem >70 miliard USD

3. Humulin Eli Lilly október 1982 • Protropin Genentech oktober 1985 • Roferon alpha2a Hoffman-La Rochejún 1986 • Intron alpha2b Shering-Plough jún1986 • Recombivax HB Merck júl 1986 • Humatrope Eli Lilly marec 1987 • Epogen Amgen jún 1989 • Energix-B SmithKline sept. 1989

4. Čo chcem povedať? • História GMO a biologickej bezpečnosti • Upresnenie základných pojmov • Základné legislatívne dokumenty • Hodnotenie rizika • Sú GMO potraviny bezpečné? • Aká je budúcnosť GMO?

5. História GMO a biologickej bezpečnosti

6. V súčasnosti sa termín GMO pre väčšinu verejnosti spája automaticky s geneticky modifikovanými rastlinami. História používania GMO sa viaže práve na mikroorganizmy. • V tomto roku je to 34 rokov, čo  Stanley Cohen a Herber Boyer pripravili prvú rekombinantnú DNA a tým zahájili éru génového inžinierstva. • S.N. Cohen et al., "Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro," Proceedings of the National Academy of Sciences, 70:3240­4, 1973

7. História diskusie o riziku technológie rekombinantných DNA je poučná do dnešných dní. 34 rokov použivania GMM nepreukázalo „nové“ neočakávané riziko. • Bola to práve vedecká komunita, ktorá si ako prvá uvedomila potenciálne riziko tejto silnej technológie. Konkrétne to bol Paul Berg, ktorý vyzval k medzinárodnému moratóriu na výskum rekombinantných DNA. • P. Berg et al., "Potential biohazards of recombinant DNA molecules," Science, 185:303, 1974

8. P. Berg mal isté pochybnosti aj preto, že pracoval s SV40 – ten má tumorigénny charakter • Jún 1973 - Gordon Conference diskutovali sa otázky bezpečnosti a požiadali NIH aby vymenoval komisiu. • Recombinant DNA advisory committe – RAC • február 1975 - Asilomarská konferencia za účasti právnikov a žurnalistov. • RAC bol rozšírený z 12 na 16 členov a prvé The Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules boli publikované 23.júna 1976. Platili len pre federálne financovaný výskum

9. Upresnenie základných pojmov

10. Geneticky modifikovaný organizmus (GMO) (LMO) je organizmus, ktorého genetický materiál bol zmenený spôsobom, ktorý sa prirodzene pri pohlavnom rozmnožovaní a prirodzenej rekombinácii nevyskytuje. • Za GMO sa nepovažuje organizmus, kde došlo ku genetickej zmene: • bunkovou fúziou prokariotických druhov mikroorganizmov, ktoré si vymieňajú genetický materiál známymi fyziologickými procesmi, vrátane fúzie protoplastov • bunkovou fúziou buniek eukaryotických druhov mikroorganizmov, vrátane fúzie protoplastov, produkcie hybridomasy a fúzie rastlinných buniek • samoklonovaním, ktoré pozostáva z odstránenia sekvencií nukleovej kyseliny z bunky, za ktorým môže nasledovať spätné vloženie všetkej odstránenej nukleovej kyseliny alebo jej časti, alebo jej syntetického ekvivalentu spolu s predchádzajúcimi enzymatickými alebo mechanickými krokmi do buniek fylogeneticky úzko príbuzných druhov, ktoré si môžu vymieňať genetický materiál prirodzenými fyziologickými procesmi, alebo bez nich.

11. Riziko Miera pravdepodobnosti a vážnosťnepriaznivých efektov W. W. Lowrance, 1976

12. Bezpečnosť Úroveň akceptovateľného rizika W. W. Lowrance, 1976

13. Riziko verzus - Bezpečnosť Meranie rizikajekvantitatívna vedecká aktivita (meranie pravdepodobnosti a zavažnosti poškodenia). Posúdenie bezpečnostije rozhodnutie o akceptácii rizika – normatívna, kvantitatívna, politická aktivita – interakcia so sociálnymi a vedeckými požiadavkami.

14. Risk Management Risk Assessment Process Initiation  Science based  Policy based Risk Communication  Interactive exchange of information and opinions concerning risks Analýza rizika

15. Analýza rizika. . . je špeciálna podskupina Rozhodovacej analýzy a na vede založeného hodnotenia „niečoho“ čo môže byť škodlivé. Political Social Legal Science Economic

16. Hranica tolerancie GMO „kontaminácie“ v rôznych krajinách (Threshold for labelling) : • Australia/New Zealand - 1% tolerance level for • accidental commingling • Brazil– 4% t.l. (proposed) • Chile – 2% t.l. (proposed) • China – 0% t.l. • EU- 1% t.l. for accidental commingling • Indonesia -5% (not being implemented, details unclear) • Japan - 5% t.l. • Korea - 3% t.l. • Russia - 0% t.l.? (not being implemented, details unclear) • Thailand– 5% t.l. (identical to Japan reg.) • Saudi Arabia – 1% t.l.

17. Ktoré faktory sú dôležité pre rozhodnutie verejnosti? • Sociálne hodnoty • Ekonomické faktory • Politické hľadisko • Právne otázky • Veda

18. Základné legislatívne dokumenty • Zákon 151/2002 • Vyhláška 252/2002 • Smernica 90/219/EHS • Smernica 18/2001/ES

19. Hodnotenie rizika

20. Čo je hodnotenie rizika? Posudzovanie rizika v oblasti biologickej bezpečnosti je vedecký postup pre identifikáciu a zhodnotenie možných dôsledkov aktivít s geneticky modifikovanými organizmami (GMO) na človeka a životné prostredie.

21. Posudzovanie rizika pokračuje systematicky, pre každý vkladaný gén, či sekvenciu zodpovedaním týchto základných otázok: • Identifikácia možných nepriaznivých účinkov. • Posúdenie závažnosti možných následkov, ak sa účinky prejavia. • Odhad pravdepodobnosti, s akou sa daný účinok môže prejaviť. • Zhodnotenie celkového identifikovaného rizika. • Zváženie príslušných bezpečnostných opatrení. • Celkové vyhodnotenie dopadu na životné prostredie.

22. II. HODNOTENIE GÉNU Žiadateľ: …………………………………………………. Spôsob použitia: ……………………………………….. Príjemca: …………………………………………………. Gén: ……………………………………………………….

23. Hostiteľ • Dôraz pri zvažovaní rizika je kladený predovšetkým na patogenicitu hostiteľského organizmu, vrátane jeho virulencie, infektivity a toxicity. Ak je náležitá, posudzuje sa tiež alergénnosť, pri tkanivových kultúrach tiež prítomnosť vedľajších škodlivých činiteľov. • Pri posudzovaní patogenicity, je dôležité zvážiť možné následky po expozícii. Ak je hostiteľský organizmus známy ako ľudský patogén, automaticky vyžaduje zaradenie do vyššej rizikovej skupiny. Ak je však recipient atenuovaný a je známe, že nie je virulentný (E. coli K12), môže byť považovaný za malé riziko, so zatriedením v najnižšej rizikovej skupine vo väčšine prípadov.

24. Posudzovanie biologického rizika použitia geneticky modifikovaných mikroorganizmov • Pri hodnotení možného rizika práce s GMMaS sú hlavným kritériom možné negatívne účinky na zdravie človeka a životné prostredie • Posudzovanie rizika GMM vyžaduje poznať negatívne účinky a to tak modifikovaného génu alebo sekvencie, ako aj  príjemcuadonora

25. Príklad zníženia rizika: • Znížiť schopnosť prežitia hostiteľa v prostredí (auxotrofné mutácie) • Znížiť schopnosť replikácie a realizácie genetickej informácie z vektora (amber mutácie, supresorové kmene) • Znížiť schopnosť horizontálneho prenosu génov(traD36)

26. Hostiteľ • Dôraz pri zvažovaní rizika je kladený predovšetkým na patogenicitu hostiteľského organizmu, vrátane jeho virulencie, infektivity a toxicity. Ak je náležitá, posudzuje sa tiež alergénnosť, pri tkanivových kultúrach tiež prítomnosť vedľajších škodlivých činiteľov. • Pri posudzovaní patogenicity, je dôležité zvážiť možné následky po expozícii. Ak je hostiteľský organizmus známy ako ľudský patogén, automaticky vyžaduje zaradenie do vyššej rizikovej skupiny. Ak je však recipient atenuovaný a je známe, že nie je virulentný (E. coli K12), môže byť považovaný za malé riziko, so zatriedením v najnižšej rizikovej skupine vo väčšine prípadov.

27. Vnášané gény a sekvencie • Toto sa týka najmä prípadov, keď produkt vnášaného génu má biologické vlastnosti, ktoré môžu byť škodlivé, napr. toxíny, cytokíny, alergény, hormóny atď. Posudzovanie musí obsahovať odhad úrovne expresie génu. • V prípadoch, keď sa vnášaný gén neexprimuje, alebo jeho produkt je v neaktívnej forme, ako sú inklúzne telieska, je málo pravdepodobný jeho škodlivý efekt. Toto je prípad expresie mnohých ľudských génov v E. coli alebo iných prokaryotických systémoch, nie však všetkých. Napr. veľa neglykozylovaných cytokínov je rozpustných a biologicky aktívnych pri expresii v E. coli.

28. Modifikácia existujúcich determinantov patogenicity • Modifikácie génov, ktorých produkty majú škodlivé účinky nie sú príliš časté, avšak je možná modifikácia už existujúcich determinantov patogenicity, vnesením iného génu, či zosilnením jeho expresie. V takomto prípade je potrebné zvažovať jednak virulenciu a patogenicitu hostiteľa, ako aj možnú virulenciu, patogenicitu a úroveň expresie vnášaného génu. Medzi determinanty patogenicity patria napríklad: bakteriálne toxíny, invazíny, integríny, povrchové štruktúry ako pili, LPS a kapsidy. Dôležitý je tiež vzťah možnej terapie pri náhodnej infekcii.

29. Posúdenie následkov možného horizontálneho prenosu • V tejto časti je posudzované riziko spojené s prípadným uvoľnením GMM do prostredia a jeho možný vplyv na príbuzné mikroorganizmy. Toto sa týka čiastočne niektorých markerov, nesúcich gény pre rezistencie na klinicky významné antibiotiká alebo intaktné provírusy. Tu hrá významnú úlohu životnosť hostiteľa, prítomnosť znaku na chromozóme alebo mobilných elementoch, vplyv selekčného tlaku prostredia  expresie/prežitia znaku, ako aj samotná prítomnosť génu v prostredí a zároveň odhad pravdepodobnosti.

30. BAKTÉRIE • Druh Klasifikácia • Acinetobacter calcoaceticus 2 • Bacillus anthracis 3 • Bacteroides fragilis 2 • Bordetella parapertussis 2 • Borrelia spp. 2 • Brucella abortus 3 • Brucella canis 3 • Brucella suis 3 • Burkholderia cepacia 2 • Burkholderia cepacia 2 • Campylobacter fetus 2 • Campylobacter jejuni 2 • Campylobacter spp. 2 • Clostridium botulinum 2 • Clostridium perfingens 2 • Clostridium tetani 2 • Coxiella burnetii 3 • Edwardsiella tarda 2 • Ehrlichia sennetsu (Rickettsia sennetsu) 2 • Ehrlichia spp. 2 • Escherichia coli 1 - 3 • Francisella tularensis (Typ A) 3 • Francisella tularensis (Typ B) 2

35. Prakticky všetky použitia modifikovaných mikroorganizmov sa dotýkajú použitia v uzatvorených priestoroch v EU doposiaľ iné použitie nebolo schválené • Directive 90/219/EEC on contained use of genetically modified microorganisms s úpravou 98/81/EC

36. Mikroorganizmus je bunkový jedinec alebo nebunkový jedinec schopný množiť sa a odovzdávať genetický materiál, vrátane vírusov, viroidov, živočíšnych buniek a buniek rastlinných kultúr. • Geneticky modifikovaný organizmus (GMO) je organizmus, ktorého genetický materiál bol zmenený spôsobom, ktorý sa prirodzene pri pohlavnom rozmnožovaní a prirodzenej rekombinácii nevyskytuje za GMO sa nepovažuje organizmus, kde došlo ku genetickej zmene: • bunkovou fúziou prokariotických druhov mikroorganizmov, ktoré si vymieňajú genetický materiál známymi fyziologickými procesmi, vrátane fúzie protoplastov • bunkovou fúziou buniek eukaryotických druhov mikroorganizmov, vrátane fúzie protoplastov, produkcie hybridomasy a fúzie rastlinných buniek • samoklonovaním, ktoré pozostáva z odstránenia sekvencií nukleovej kyseliny z bunky, za ktorým môže nasledovať spätné vloženie všetkej odstránenej nukleovej kyseliny alebo jej časti, alebo jej syntetického ekvivalentu spolu s predchádzajúcimi enzymatickými alebo mechanickými krokmi do buniek fylogeneticky úzko príbuzných druhov, ktoré si môžu vymieňať genetický materiál prirodzenými fyziologickými procesmi, alebo bez nich.

37. Pri hodnotení rizík spojených s GMM musíme predovšetkým brať do úvahy účel použitia: • Farmaceutické výroby (rekombinantné proteíny a peptidy) • Priemyselné fermentácie (aminokyseliny, organické kyseliny, rozpúšťadlá,) • Potravinárske aplikácie mikroorganizmov • Environmentálne využite mikroorganizmov (bioremediácie, biometalurgia)

38. Farmaceutické výroby • výhoda použitia baktérií vo výrobe • zvládnutá expresia • technológia purifikacie je zahrnutá už v príprave rekombinantu • stredne veľké fermentácie pre väčšinu produktov

39. schválených približne 200 produktov • vo vývoji okolo 2000 produktov • otázky dĺžky schvaľovacieho procesu • inzulin schvaľovanie 2 roky • duševné vlastníctvo - EPO • problém obsahu DNA vo výslednom proteíne

40. Priemyselné fermentácie • výroba priemyselných enzýmov –GMO? • aminokyseliny • produkcia sekundárnych metabolitov • metabolické inžinierstvo – GMO?

41. Potravinárske aplikácie mikroorganizmov • Použitie mikroorganizmov vo výrobe potravín veľmi staré • Probiotické kultúry • Analógia s „GMO potravín“

42. Environmentálne využitie mikroorganizmov • riziko „nekontrolovateľného úniku“ organizmov alebo génov do prostredia • antibiotiková rezistencia – resp. iné selekčné márkre • dilema medzi „bezpečnosťou“ a selekčnou výhodou

43. Najčastejšie používané GMO

44. Prehľad transgénov použitých pre genetickú modifikáciu rastlín • Transgény upravujúce agronomické vlastnosti rastlín • Transgény pre toleranciu(T) voči špecifickým herbicídom(H) (HT-transgény) • Transgény pre rezistenciu voči hmyzím škodcom a háďatkám • Transgény pre rezistenciu voči baktériám a hubám • Transgény pre rezistenciu voči vírusom a viroidom • Transgény pre samčiu (peľovú) sterilitu

45. Transgény upravujúce výživové a iné parametre plodín používaných pre priamu konzumáciu a vo výrobe potravín • zvýšenáj akumulácia olejovej kyseliny • tabak so zníženou hladinu nikotínu (20x) • oneskorené alebo regulované dozrievanie • zlatá ryža • Transgény pre produkciu liečív a biologík • Transgény pre produkciu priemyselných chemikálií • Transgény odolné voči stresom

46. Sú GMO potraviny bezpečné? • Zle formulovaná otázka • Je miera rizika spojená s GMO prijateľná? • Princíp ekvivalencie • Výrobky z GMO sú najlepšie testované

47. Aká je budúcnosť GMO?

48. v roku 2003 sa uskutočnil prieskum medzi privátnymi firmami a vedeckými inštitúciami. 39% oslovených subjektov zrušilo v posledných štyroch rokoch výskumné projekty súvisiace s GMO v dôsledku nejasného regulačného rámca a neistej situácie na trhu. • tendencia zrušenia výskumných projektov bola nižšia vo verejnom sektore (29 % oslovených subjektov, ktoré zrušili projekty) a bola vyššia v privátnom sektore (61%). • podobný jav bol pozorovaný v prípade pokusného pestovania GM rastlín, po prudkom náraste v rokoch 1991-1998 nasledoval prudký pokles o 76 % do koncar. 2001.

50. Vzťah verenosti k biotechnológiám a následné konzekvencie pre podporu výskumu