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Amplificazione genica: i sistemi commerciali. Dr. Claudio Piersimoni Gruppo di Lavoro Micobatteri AMCLI. Firenze, 19-22 gennaio 2009. Parleremo di:. Definizioni e caratteristiche Indicazioni per l’uso Performance analitiche Impatto clinico Costo-efficacia
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Amplificazione genica: i sistemi commerciali Dr. Claudio Piersimoni Gruppo di Lavoro Micobatteri AMCLI Firenze, 19-22 gennaio 2009
Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità
I test di amplificazione diretta (DAT) • consentono il simultaneo rilevamento ed identificazione del Myc. tuberculosis complex direttamente dai campioni clinici. • i risultati sono disponibili nel giro di poche ore • non possono sostituire, ma affiancano i metodi convenzionali.
La PCR real-time • La PCR real-time (qRT-PCR) presenta indiscutibili vantaggi rispetto alla cnPCR: • Rapidità • Ampio range di quantificazione del target • Riduzione della contaminazione da amplicons • Alta sensibilità intesa come più basso limite di detection
Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità
Uso autorizzato (FDA) • Campioni respiratori • Contemporanea esecuzione di microscopia e coltura • Raccolti da pazienti non trattati • Microscopia positiva per BAAR • Amplicor ed E-MTD • Microscopia negativa per BAAR • esclusivamente E-MTD
Algoritmo 1 MMWR 2000; 49: 593-594
Algoritmo 2 MMWR 2000; 49: 593-594 clinicaljudgment
Uso accessorio • Campioni extrarespiratori • Risultati più affidabili con: • Microscopia positiva • Aspirati gastrici, pus, biopsie • Risultati meno affidabili con: • Microscopia negativa • Liquor o altri liquidi sierosi
Uso accessorio • Diagnosi di TB in pazienti trattati su base clinica che presentino: • esame microscopico positivo • esame microscopico e/o colturale negativi • Identificazione di Myc. tuberculosis complex in colture inquinate • Ricovero in isolamento respiratorio per pazienti con sospetta TB polmonare (single first-sputum)
DAT ed isolamento respiratorio Am.J.Respir.Crit.Care Med. 2008; 178: 300-305
Modalità d’uso • Impiego mirato sulla base di un congruosospetto clinico • clinical skills are uneven entities • di norma sul primo di tre campioni • La resa diagnostica del test dipende in larga misura da: • qualità del campione • appropriatezza della sede di prelievo
Selezione dei pazienti • Indicatori predittivi di PTB • Immigrazione • Infezione da HIV • Dimagrimento • Sudorazioni notturne • Lesioni polmonari • cavitarie • in sede apicale
Selezione dei pazienti Van den Wijngaert et al. JCM 2004; 42: 837-838 *; Cobas Amplicor Roche
Tempi di refertazione Am.J.Respir.Crit.Care Med.2005; 172: 1169-1227
Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità
I dati della letteratura • i vizi [bias] metodologici inficiano la attendibilità dei dati della letteratura • i più comuni bias possono alterare: • accuratezza • specificità
Parametri metodologici JCM 2003; 41: 3233-3240 • Studio prospettico eseguito in cieco • Golden standard microbiologico e clinico • Esclusione dei campioni raccolti da pazienti in terapia • Valutazione separata dei campioni respiratori ed extrapolmonari • Valutazione di 3 campioni a pz. per minimizzare la “uneven distribution” dei micobatteri nel campione • Sensibilità e specificità calcolate per pz., non esclusivamente per campione
Le metanalisi (campioni respiratori) Thorax 2006; 61: 783-790
Le metanalisi (liquor) Lancet ID 2003; 3: 633-643
Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità
BD Probetec ET J. Infect. 2005; 50: 187-192
Impatto clinico dei DAT E-MTD Catanzaro et al. JAMA 2000; 283: 639-645
“Peso” nella decisione terapeutica Am. J. Respir. Crit. Care Med.1997; 155: 1497-98
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Costo-efficacia • I test diagnostici a costo mediamente elevato possono ridurre la spesa sanitaria se: • Aumentano la accuratezza diagnostica • Riducono i tempi di degenza
Dipende da: No./anno di campioni microscopico-positivi Prevalenza di TB nei campioni microscopico-positivi Costo giornaliero dell’isolamento respiratorio Si incrementa in caso di: Alta prevalenza di MNT Esecuzione dei DAT presso laboratori regionali di riferimento Costo-efficacia dei DAT
Strategie di utilizzo dei DAT JCM 2008; 46: 3811-3812 E-MTD
Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità
Problemi sul tappeto • Falsi negativi • Diluizione del pellet • Presenza di inibitori • Controllo interno di amplificazione (CIA) • Insufficiente estrazione del target • Falsi positivi • Contaminazioni crociate • Selezione dei pazienti • Qual’è il gold standard ? • Quali micobatteri si evidenziano ?
Caratteristiche del CIA JCM 2004; 42: 1863-1868 • Acido nucleico • DNA plasmidico • Siti di legame dei primers • i medesimi del target • Amplicons derivati dal CIA • Differenziabili da quelli del target
Lysis Elution buffer Glass fiber Extraction Adsorption Phenol chloroform Precipitation Elution Ethanol Estrazione: metodi a confronto
Sistemi commerciali di estrazione Clin. Microbiol. Rev. 2006; 19: 165-256
Modifiche dei kit commerciali JCM 2004; 42: 5341-5344 [..]test confermati positivi dopo ripetizione (fra 30.000 e 499.000 RLUs).
Modifiche dei kit commerciali JCM 2009; 47: 282-283 st-DTB = ProbeTec (estrazione per lisi) me-DTB = ProbeTec (estrazione per lisi + cattura [NucliSens])
Parleremo di: • Definizioni e caratteristiche • Indicazioni per l’uso • Performance analitiche • Impatto clinico • Costo-efficacia • Come implementare gli attuali sistemi • Controllo di qualità
Considerazioni generali • Competenza in micobatteriologia (utilizzo per disciplina, non per tecnica) • Idoneità delle strutture • Addestramento del personale • Partecipazione a programmi di “proficiency”
Valutazione esterna di qualità Noordhoek et al. CMI 2004;10: 295-301
Valutazione esterna di qualità Noordhoek et al. CMI 2004;10: 295-301
I commenti degli Autori • I risultati sembrano essere influenzati più dalla tipologia degli utilizzatori che dalle caratteristiche dei metodi • Solo il 61.2% dei campioni microscopico-negativi sono stati risposti come positivi • E’ stata riscontrata una percentuale del 4.3% di falsi positivi
Valutazione esterna di qualità Dati INSTAND
Conclusioni • Dato l’attuale costo dei DAT commerciali, è indispensabile privilegiare la appropriatezza • Utilizzo in base al sospetto clinico • Selezionando il sito più appropriato per il prelievo dei campioni da testare • Facendo attenzione alla qualità dei campioni • La sensibilità nei campioni “smear-negative” è ancora insoddisfacente • Evitare il più possibile l’uso al di fuori della indicazioni della letteratura