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APPORT DE LA CYTOMETRIE A FLUX DANS LE DIAGNOSTIC ET

Les 4èmes Journées Maghrébines d’Hématologie Les 9èmes Journées Nationales d’Hématologie 26,27 et 28 Avril 2007 . APPORT DE LA CYTOMETRIE A FLUX DANS LE DIAGNOSTIC ET . LA CLASSIFICATION DES THROMBASTHENIES DE GLANZMANN.

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APPORT DE LA CYTOMETRIE A FLUX DANS LE DIAGNOSTIC ET

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  1. Les 4èmes Journées Maghrébines d’Hématologie Les 9èmes Journées Nationales d’Hématologie 26,27 et 28 Avril 2007 APPORT DE LA CYTOMETRIE A FLUX DANS LE DIAGNOSTIC ET LA CLASSIFICATION DES THROMBASTHENIES DE GLANZMANN H.ELLEUCH, S.MSEDDI, I.BEN AMOR, H. REKIK, T.SUISSI, J.GARGOURI Centre Régional de Transfusion Sanguine de Sfax Service d’Hématologie CHU. H. Chaker – Sfax

  2. INTRODUCTION (1) TG : • Anomalie Felle • Déficit quantitatif ou qualitatif des GP IIbIIIa (intégrines αIIbβ3) • Autosomale récessive • Cause de saignement clinique

  3. INTRODUCTION (2) Exploration biologique : • TS/TO • Num. Plaq. • MO • Fonctions plaquettaires • SDS PAGE (classification) • BM • Phénotype membranaire (CMF)

  4. INTRODUCTION (3) Etude par CMF: • Méthode simple et précise • Les données recueillies: • Le % des cellules qui expriment l’Ag • L’intensité moyenne de fluorescence (IMF) IMF est proportionnelle à la quantité de sites antigéniques à la surface des plaquettes

  5. Représentation schématique d’une plaquette 1-GP IV: thrombospondine et collagène 2-GP IIbIIIa: fibrinogène et vWF 3-microtubules 4-lysosome 5-GP IaIIa: collagène 6-recepteur de thrombine 7-glycogène 8-système canaliculaire 9-granule α 10-GP IbIXV: vWF 11-granule dense 12-GP IcIIa

  6. Complexe GPIIbIIIa: intégrine αIIbβ3

  7. MATERIELS *Groupe témoin : 10 donneurs de sang • 5 F / 5 H • Sans ATCD de troubles de l’hémostase • Age moyen : 36,4 ans (25-51 ans) • Taux moyen de plaquettes : 294,2 103/µl * 13 patients: • 5 F / 8 H • Classés type I ou II par l’étude de la rétraction du caillot et/ou le SDS PAGE

  8. Caractéristiques des patients

  9. METHODES (1) Pour ces 2 groupes : • Prélèvements : 2 tubes sur citrate de sodium 1 tube sur EDTA • Agrégation plaquettaire : Chrono-Log 500VS Méthode optique Sur PRP ADP : 20µM Collagène : 5µg Acide arachidonique (AA) : 2mM Ristocétine : 1,25 µg

  10. METHODES (2) • CMF :Coulter EPICS XL • CD41a-PE clone HIP8: GPIIb (αIIb integrin) BD. Bioscience • CD61-PE clone SZ21: GPIIIa (β3 integrin) Immunotech • CD42b-FITC clone HIP1: GPIbBD. Bioscience • Mouse IgG1-FITC et IgG1PE BD. Bioscience Pour chaque échantillon : IgG1-FITC/IgG1-PE CD42b-FITC/CD41a-PE CD42b-FITC/CD61-PE

  11. METHODES (3) • Sang avec EDTA PRP + GR • Culot plaquettaire + PPP • 2 lavages PBS + EDTA à 0,33% • Resuspension dans le PBS à une cc de 105/µl • 50µl de plaquettes + 10 µl Ac • Incubation 30 mn à l’obscurité • 200 µl de solution de lyse (10 mn) • lavage PBS Resuspension PBS Lecture

  12. RESULTATS (1) Agrégation plaquettaire Groupe Témoin : p<0,01 Patients :

  13. RESULTATS (2) Étude en CMF % des cellules Ag+ : patients classés Type I

  14. RESULTATS (3) Étude en CMF Groupe Témoin : p<0,01 P=0,56 p<0,01 Patients :

  15. RESULTATS (4) Étude en CMF Patients : p<0,01 P=0,14

  16. Contrôle

  17. TG type I IMF: 2,41 IMF: 38,3

  18. TG type I IMF: 1,28 IMF: 43

  19. TG type I

  20. TG type II IMF: 4,49 IMF: 28,4

  21. TG type II IMF: 37,2 IMF: 31,7

  22. TG type II

  23. COMMENTAIRES (1) Pour le type I • CD41a: 18,63% de la normale • CD61: 0,74 % de la normale • Surexpression de la GPIb:112,88% Pour le type II • CD41a:49,13% de la normale • CD61: 6,71 % de la normale • expression de la GPIb:81,69%

  24. COMMENTAIRES (2) Peu d’études sont réalisées dans ce sens: • Etude indienne: Am.J.Hematol. 2003 : 10 Patients: CD41 et CD61 6 Type I: absence de GP IIb IIIa 3 Type II: GP IIb IIIa de 7,72 à 20,40 % de la normale 1 Variant: GP IIb IIIa de 46 %, RC: 60 %

  25. COMMENTAIRES (3) • La détermination de l’IMF quantifier le nombre de molécules à la surface des cellules • Il y’a des trousses permettant de quantifier les GP: nombre de sites antigéniques utilisation d’une gamme de calibration (4 suspensions de billes de calibration correspondant chacune à un taux connu de sites antigéniques) Conversion de l’IMF en nombre d’Ac fixés par cellule

  26. CONCLUSION (1) • Proposition d’une classification pour la TG: Type I IMF (CD41a): 0 à 20 % de la normale et/ou IMF (CD61): 0 à 2 % de la normale Type II ou variants: IMF (CD41a) > 20 % de la normale et IMF (CD61) > 2 % de la normale

  27. CONCLUSION (2) • Notre étude doit être complétée Confirmation de nos résultats sur un effectif beaucoup plus important • Etude par CMF de la capacité des plaquettes activées à lier le fibrinogène (Variants)

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