OBIECTIVE:

1. TULPINI BACTERIENE NECESARE SISTEMULUI DE AGRICULTURĂ PE BAZĂ DE MULCI BIOACTIV IZOLATE DIN ZONA DE SUD-EST A ROMÂNIEI Florica CONSTANTINESCU1, Sorina DINU1, Oana SICUIA1, Roxana ZAMFIROPOL1 1 - Institutul de Cercetare-Dezvoltare pentru Protecţia Plantelor

2. Proiect Makis : Sistem de agricultură alternativă pe bază de mulci vegetal bioactiv format din culturi verzi OBIECTIVE: 1 Dezvoltareaunuisistem de agriculturăalternativăprinutilizareamulciului vegetal bioactiv format din culturiverzi deleguminoase (mazăre, măzăriche, lupin, sulfinăalbă) şi din culturiverzi de crucifere(rapiţă, muştar). 2 Diseminareapescarălargă a sistemului de agriculturăalternativă, cu reliefarearezultatelorclareşisemnificativavantajoasepentruproducătoriiagricoli.

3. Izolaretulpini Biopreparateinoculantepebază de bacterii din grupulRhizobium Selecţietulpini Formularebiomasă Biopreparatedestinateformăriimulciuluibioactiv, pebază de bacteriisporulate din genulBacillus

4. Grupul Rhizobium • Bacterii simbionte • Fixatoare de azot • Asigura un aport de 100-300 kg azot substanta activa/ha Noduli pe radacina unei plante leguminoase Plantă de mazăre (Pisum sativum) Bacteroizi în interiorul unui nodul

5. Tulpini specifice diferitelor culturi de protecție în timpul iernii Rhizobium leguminosarum bv. viciae Rhizobium lupini Mazăre de iarna Măzăriche de toamnă Lupin

6. Biopreparate pe bază de Rhizobium leguminosarum • Avantaje: • Îmbogățirea cu azot a solului fără a determina poluare; • Creșterea fertilității solului prin îmbunatățirea structurii (producere EPZ); • Stimularea creşterii plantelor datorită producerii de fitohormoni.

7. Bacillus subtilis • Utilizat în combaterea biologică a fitopatogenilor • Formează spori – foarte rezistenți la factorii de stress din mediu Biopreparate existente pe piața mondiala Epic (Gustafson, SUA) Serenade (Agra Quest, UE, SUA) Kodiak (Gustafson, SUA) System (SIAPA, UE)

8. Avantajele biopreparatelor pe bază de Bacillus subtilis în sistemul agricol propus • Creșterea capacității de mineralizare a materialului vegetal • Diminuarea cantității sporilor ciupercilor fitopatogene de sol din mulci • Stimularea creșterii plantelor prin producerea de auxine sau gibereline • Asigurarea unor recolte sporite simultan cu reducerea aplicării pesticidelor

9. Izolarea de tulpini biologic active din Bărăganul de sud si Dobrogea de sud • Probe de sol din culturi de crucifere, leguminoase și miriște. • Probe vegetale din plante de rapiță. • 356 tulpini bacteriene au fost analizate și caracterizate în scopul selecției

10. Selecţia izolatelor bacteriene s-a realizat pe baza următoarelor caracteristici: • Capacitatea antagonistăin vitro; • - Producerea de enzime:proteaza,celulaza, amilaza, lactonaza; • Mobilitatea izolatelor; • Stimularea creşterii plantelor; • Producerea de hormoni de creştere (IAA) şi • Testarea inocuităţii izolatelor.

11. Identificarea bacteriilor izolate • Teste biochimice şi coloraţia Gram G- G+ • Testul Biolog de degradare oxidativă a diferitelor substrate, cuplat cu baze de date specifice. • Identificarea microorganismelor selectionate până la nivel de specie prin amplificarea 16s rADN prin tehnica PCR.

12. Selecţia tulpinilor bacteriene Activitatea antagonistăs-a analizat in vitrofaţă de Fusarium spp., Alternaria spp, Botrytis spp., Sclerotinia sclerotiorum şi Sclerotium bataticola Metoda culturilor duble Metoda înţepării punctiforme a mediului Versus Sclerotium bataticola Versus Alternaria spp. Versus Fusarium graminearum

13. Producerea de enzime 56.1s MB2 Us1 FL400 Celulază (tulpinile 56.1s; 53, 54, 55) Protează Amilază (tulpina 56.1s)

14. Producerea de enzime Quorum sensing Lactonază CV026 Ps33 Fl400

15. Testarea mobilităţii PCL1764 56.1s Mobilitatea de migrare la suprafaţa agarului (swimming) Mobilitatea de agregare (swarming)

16. Tulpini selectate FL400 – Paenibacillus graminis – izolat din rizosferă de grâu Enzime produse: proteaza, amilaza, lactonaza. Produce metaboliţi antifungici - antagonistă faţă de toate ciupercile de sol studiate. Mobilitate: de migrare si de agregare. Stimulează creşterea plantelor de tomate şi de fasole Stimulează formarea nodozitaţilor pe rădăcini de plante leguminoase. Identificat pe baza 16s rADN.

17. 56.1s - Brevibacillus laterosporus – izolat din sol Enzime produse: proteaza, amilaza, lactonaza. Produce metaboliţi antifungici - antagonistă faţă de toate ciupercile de sol studiate. Mobilitate: de migrare şi de agregare. Stimulează creşterea plantelor de tomate. Identificat pe baza 16s rADN.

18. Us1 – Bacillus marisflavi – izolat din rizosfera de usturoi Enzime produse: proteaza, amilaza, lactonaza. Producere de metaboliţi antifungici. Mobilitate: de migrare şi de agregare. Stimulează creşterea plantelor de tomate. Identificată pe baza 16s rADN.

19. Biotestarea in vitro a efectului fitostimulator asupra plantulelor de grâu • Spor de creştere al rădăcinilor, faţă de martor, cuprins între 9,28% şi 25,77%. Martor Varianta FL400 (107 ufc/ml) Seminte de grâu germinate dupa 72 ore de la inoculare cu tulpina de Paenibacillus graminis FL400 vs. Martor

20. Testarea in vivo a izolatelor bacteriene selecţionate în ceea ce priveşte stimularea creşterii plantelor de tomate Varianta tratată cu tulpina FL400 Var. tratata cu tulpina 56.1s Mt neinoculat

21. Testarea in vivo a tulpinilor bacteriene selecţionate pe plante de măzăriche de toamnă Bloc randomizat cu 4 variante in 4 repetitii: V1= Martor nebacterizat V2= Tratament la samanta cu B49b V3= Tratament la samanta cu FL400 V4= Tratament la samanta cu B49b +FL400 B49b - Bacillus subtilis FL400 – Paenibacillus graminis Experienţă cu plante de Vicia villosa în câmpul I.C.D.P.P. (foto O. Sicuia, ianuarie 2010)

22. Producerea de fitohormoni auxinici (IAA- acid indolil 3-acetic) Producerea de IAA (acid indolil 3 acetic) în prezența sau absențatriptofanului. *Valorile reprezinta cantitatea de IAA în µg/ml în supernatantul culturii dupa 8 zile de creștere a bacteriilor în mediul nutrient broth suplimentat sau nu cu triptofan (100µg/ml).

23. Testarea inocuităţii izolatelor selecţionate Se determină cu ajutorul biotestului de inocuitate pe bază de larve de Galleria mellonela. Inocularea larvelor cu suspensii bacteriene în concentraţie de 102 ufc/ml şi 106 ufc/ml

24. Concluzii • Au fost selecționate 3 tulpini de microorganisme cu activitate biologică ridicată care au provenit din Baraganul de sud. • Tulpinile sunt depuse la autorităţi de depozit internaţional şi sunt în curs de brevetare. • Pe baza acestor tulpini vor fi produse biopreparate bacteriene destinate sistemului de agricultură pe bază de mulci bioactiv.