موضوع : آنتی بادی منوکلونال

2. موضوع :آنتی بادی منوکلونال استاد : مهندس بهشتی مآل نام تهیه کننده : مهناز غیور

3. Ab مونوکلونال : وقتی یک آنتی ژن وارد دستگاه گردش خون شود ، لنفوسیت ها را تحریک می کند تا آنتی بادی تولید کنند . آنتی بادی به طور اختصاصی با آنتی ژن ترکیب می شود . هنگامی که سیستم ایمنی با یک آنتی ژن مواجه می شود فقط به شاخص های ویژه ای از آن آنتی ژن واقع در نواحی مشخصی از سطح آن که اپی توپ نامیده می شود پاسخ می دهد . Abمونوکلونال : توانایی تولید مقادیر نامحدود آنتی بادی یکسان ویژه ی یک آنتی ژن خاص یا به عبارت دیگر یک جمعیت لنفوسیستی قادر باشند یک نوع Ab تولید کنند . .

4. آنتی بادی مونوکلونال

5. تولید پادتن های مونوکلونال از تومور های هیبریدوما a:سلول مناسب تولید کننده آنتی بادی مونوکلونال پادتن ها توسط دسته ای از لنفوسیت ها به نام پلاسما سلها تولید می شود به منظور تولید MAB ها باید به ترتیب : جدا سازی لنفوسیت ها 2. کشت آنها در محیط خارج از موجود زنده 3. خارج کردن کلن مربوط به تولید پادتن را انجام داد . البته دو مشکل وجود دارد : 1. کشت سلولهای طبیعی لنفوسیت B موفقیت آمیز نیست 2. جهت تهیه پادتن به صورت نامحدود ، دودمان سلولی نامیرا به تولید پادتن نیاز است . در وضعیت بیماری میلومای چندگانه سلول نامیرا وجود دارد .

6. سلول B

7. تولید پادتن های مونوکلونال از تومور های هیبریدوما • نکته : در محیط کشت به طور خودبخودی می توان سلولها را با یکدیگر مرتبط و در هم آمیخت . این فرآیند با موادی مانند پلی اتیلن گلیکول افزایش داد.فرآورده آن ناجورهسته است. • دو دانشمند (کولر و میلستین) لنفوسیت های طبیعی تولید کننده پادتن موش را با دودمان سلولی میلومای این جانور ترکیب نمودند و حاصل آن تولید سلول هیبریدوما بود که قادر به رشد دائمی در محیط کشت بود ، شد .

10. تولید پادتن های مونوکلونال از تومور های هیبریدوما • b:خصوصیات سلول میلومای مورد استفاده : • سلول میلوما باید واجد دو ویژگی باشد : 1. دودمان سلولی میلومای بکار رفته نباید قادر به ترشح پادتن باشد . (مواردی از بیماری میلومای چندگانه وجود دارد که در آن لنوسیت ویژه ای بدون تولید پادتن ، به گونه ای کنترل نشده تکثیر می یابند . ) • 2. سلولهای میلوما به طور اختصاصی در محیط دارای (8-آزاگوانین) • انتخاب می شوند . (تنها سلولهایی زنده می مانند که در آنزیم HPRT دچار نقص هستند . )

11. محیط کشت HAT هنگامی که سلولهای بدون HPRT در محیط کشت HAT (مخلوطی از هیپوگزانتین، آمینوپترین و تیمیدین) رشد داده شوند ، به دلیل عدم توانایی سنتز DNA می میرند . دلیل آن این است که آمینوپترین مسیر عمده بیوسنتز پورین و پیریمیدین را مسدود می کند . اما سلولهای طبیعی با استفاده از تیمیدین ، به سنتز پیریمیدین ها می پردازد و با بکار گیری آنزیم HPRT قادرند از هیپوگزانتین پورین ها را بسازند .

12. مبانی انتخاب برای استفاده از محیط کشت HAT

13. مبانی انتخاب برای استفاده از محیط کشت HAT تنها سلولهای هیبریدوما در محیط کشت HAT با موفقیت رشد می کنند . زیرا : از سویی توانایی رشد در محیط کشت خارج از موجود زنده را از سلولهای میلوما و از سوی دیگر ژن طبیعی مربوط به سنتز آنزیم HPRT را از لنفوسیت ها کسب کرده اند .

14. ساختن هیبریدوما نقطه آغاز ساختن سلولهای هیبریدوما که قادر به ترشح پادتن مونوکلرونال خاص باشند ایجاد ایمنی در جانوری مثل موش بوسیله Ag مناسب است . به این منظور : 1.تزریق Agبه همراه ماده کمکی زیر پوست یا صفاق جانور 2.کشتن جانور3. شستن طحال و خرد نمودن آن 4. تکان دادن آن 5. سانتریفوژ کردن آن 6.شستشو 7 . مخلوط کردن لنفوسیت ها با سلولهای HPRT منفی میولما 8. قرار گرفتن در معرض پلی اتیلن گلیکول .9.تعلیق در محیط کشت تازه 10 . شستشو 11.انتخاب سلولهای هیبریدوما بوسیله محیط کشت HAT

15. مراحل مربوط به تولید هیبریدوما

16. ساختن هیبریدوما سلولهای شسته شده شامل : مخلوطی از هیبریدوما ، سلولهای میلومای منفرد و سلولهای لنفوسیتی الحاق نیافته است . از آنجایی که تمام سلولهای هیبریدومای به دست آمده پس از ترکیب با هم رشد داده شده اند مخلوطی ازAbهای پلی کلونال بدست می آید اما ما به دنبال MABها هستیم . بنابراین سلولهای هیبریدومای تولید کننده پادتن منفرد جدا می نماییم و به طور انفرادی کشت می دهیم .

18. آنتی بادی کایمریک طبیعت عملکردهای Ab به ما این امکان را می دهد که Ab مونوکلونال موش را به Ab تبدیل کنیم که در برخی جاها قطعات انسانی داشته باشد . به این Ab هیبرید ، آنتی بادی کایمریک یا نیمه انسانی می گوییم .اولین بخش ازAb مونوکلونال موش که قرار بود جایگزین توالی انسانی شود ، قطعه FC آنتی بادی موش بود .بنابراین محققان توالی هایی از DNAرا که مناطق FVزنجیره های L و H ایمونو گلوبولین انسانی را کد می کرد ، با توالی های FVDNA مربوط به زنجیره های L ,H از Abمونوکلونال خاصی در موش جایگزین نمودند .

19. کاربردها ی آنتی بادی مونوکلونال • 1.تولید و کنترل کیفی Ab مونوکلونال نشان دار با تکنسیم 99m علیه سلولهای سرطانی کولون • 2. استفاده از Ab مونوکلونال جهت درمان تومورها • 3.استفاده از Ab مونوکلونال جهت درمان ترومبوز سیاهرگها • 4. تعیین خصوصیات Ab مونوکلونال برعلیه تومور مارکرHer2 • 5.تولید و بررسی خصوصیات Ab مونوکلونال موشی علیه اپی توپهای فضایی هورمون (hcG) • 6.Ab مونوکلونال دارای اتصال شیمیایی • 7.تولید Ab مونوکلونال علیه پروتئین پوششی نو ترکیب ویروس عامل بیماری ریزومانیای چغندرقند • 8.در بیماری قلبی عروقی ، بیماری التهابی ، بیماری های خود ایمنی، بیماری MS، آلرژی و ...

20. تولید و کنترل کیفی Ab مونوکلونال نشان دار با تکنسیم 99m علیه سلولهای سرطانی کولون • Abهای مونوکلونال امروزه به عنوان عوامل تشخیصی بهسازی می شوند . در اینجا Ab مونوکلونال برعلیه سلولهای سرطان روده تهیه شده و نشان دار سازی آنها با رادیو ایزوتوپ تکنسیم 99m صورت گرفته است . • روش ها :این پژوهش در سه مرحله صورت گرفته که شامل : 1. تهیه سلولهای هیبریدوما علیه سلولهای سرطانی روده (HT29) • 2. تولید Ab مونوکلونال با رشد هیبریدوما در محیط کشت • 3. بدست آوردن خصوصیات آن و نشان دار سازی آن با تکنسیم 99m • Ab مونوکلونال تولید شده قادر به شناسایی Ag رویانی سرطان می باشد . • این Ag پروتئینی غشایی با گلیکوزیلاسیون زیاد است . این Ab به غربالگری سرطان در میان افراد جمعیت ، تشخیص سرطانهای بدخیم دستگاه گوارش ،تشخیص جایگاه تومور و درمان سرطان به کار می رود

21. carcinoembryonic antigen (CEA)

22. استفاده از Ab مونوکلونال جهت درمان تومورها Ab نشان دار شده توسط رادیو ایزوتوپها را می توان برای درمان سرطان و همچنین به منظور تشخیص مراحل معینی از بیماری ها از جمله سرطان به کار برد . MAB های اختصاصی تومور برای محل یابی سرطان های اولیه یا متاستازداده بکار می رود MAB مناسب از طریق سیاهرگ وارد می شود و در محل های تراکم Ag مجتمع می گردد . و این نقاط به کمک ابزارهایی مانند دوربین گاما شناسایی می شود . ایزوتوپ مناسب آن تکنسیم 99m است.

23. تومور

24. تومور رحم تومور کبدی

26. تعیین خصوصیات Ab مونوکلونال برعلیه تومور مارکرHer2 پیشگیری از سرطان پستان که شایع ترین سرطان در میان زنان محسوب می شود ، غالبا ً امکان پذیر نیست . تشخیص سریع بهترین راه حل است و یکی از مهم ترین راههای تشخیصی ، بررسی تومور مارکرهای سرطان پستان و در رأس آن بررسی بیان Her2 در بافت سرطان است . Her2 یک پروتوآنکوژن است که بر روی کروموزوم 17 قرار دارد .Ab مونو ضد Her2 به طور وسیع در آزمونهای تشخیصی و همچنین درمان این سرطان مورد استفاده قرار می گیرد . در این تکنیک دو پپتیدP1Her2 و Her2 P2را به موش تزریق می کنند وAb مونوکلونال ضد این پپتیدها را جهت درمان سرطان استفاده می کنند .

27. تعیین خصوصیات Ab مونوکلونال برعلیه تومور مارکرHer2

28. تولید و بررسی خصوصیات Ab مونوکلونال موشی علیه اپی توپهای فضایی هورمون (hcG) • هورمون hcG تنها عضو خانواده هورمون ها گلیکوپروتئینی است که توسط جفت ترشح می شود . سایر هورمون های این خانواده شامل : LH، FSH، TSHاز غده هیپوفیز ترشح می شود و اعضای این خانواده از دو زیر واحد آلفا(یکسان) و بتا(متفاوت) تشکیل شده اند .با این وجود بین زیرواحد بتای hcG و بتای هورمون Hlh همولوژی وجود دارد .این دو هورمون یک نوع گیرنده دارند.بنابراین تشخیص hcGبا Ab مونوکلونال مشکلات زیادی دارد راه حل این مشکل تولید Ab علیه اپی توپهای اختصاصی این هورمون هاست

29. هورمون hCG

30. تولید و بررسی خصوصیات Ab مونوکلونال موشی علیه اپی توپهای فضایی هورمون (hcG) • این Ab فقط با فرم دایمر hcG طبیعی و نوترکیب واکنش قوی دارد . • از Abهای مونوکلونال علیه hcG در تشخیص بارداری ، بیماری های تروفوبلاستینگ و تشخیص انواع سرطانها و تومورهای غیر تروفوبلاستینگ و تشخیص به موقع بارداری های نابه جا ، سندروم دان استفاده می شود .

31. استفاده از Ab مونوکلونال جهت درمان ترومبوز سیاهرگها • در این روش MAB های مربوط به فیبرین را می توان برای تعیین محل انعقاد خون به کار برد . • در اینجا نیز MAB مناسب از طریق سیاهرگ وارد می شود و در محل های تراکم Ag قرار می گیرد . این نقاط به کمک دوربین گاما شناسایی می شود .

32. درمان ترومبوز بوسیله Ab مونوکلونال عمده مرگهای طبیعی در امریکای شمالی و اروپا به دنبال ترومبوز یا مسدود شدن یک شریان نخاعی یا کرونری توسط لخته خون رخ می دهد . ترومبوز از شبکه ای از فیبرین تشکیل شده . فیبرین یک عامل لخته کننده خون است .در شرایط طبیعی پلاسمین که یک سرین پروتئاز می باشد از طریق فعال شدن پلاسمینوژن با فعال کننده پلاسمینوژن تولید می شود . فیبرین لخته خون را تجزیه کرده اما اگر این سیستم بیولوژیکی ، لخته های خونی را به خوبی از بین نبرد ، شریان مسدود می گردد و این امکان طرح شد که شاید بتوان از فعال کننده های پلاسمینوژن به عنوان عوامل درمانی برای تحریک تولید بیشتر پلاسمین بهره جست . پلاسمین می تواند فیبرینوژن را نیز تجزیه کند ، بنابراین این روش درمانی به دنبال کاهش در مقدار فیبرینوژن به خونریزی داخلی شدید می انجامد .

33. درمان ترومبوز بوسیله Ab مونوکلونال

34. درمان ترومبوز بوسیله Ab مونوکلونال بنابراین عوامل ترومبولیتیک که تنها قادر به تجزیه فیبرین لخته خون باشد ابداع شد . بدین صورت که : محققان با اتصال یک آنتی بادی از طریق پیوندهای کووالان به فعال کننده پلاسمینوژن قادر خواهند بود .اولا ً : فیبرین را هدف یابی کرده وثانیا ً پس از اتصال Ab به لخته با تبدیل پلاسمینوژن به پلاسمین موجب افزایش مقدار پلاسمین تجمع یافته شوند . جهت این امر محققان فعال کننده پلاسمینوژن مختص به بافت را به طور شیمیایی به یک Ab مونوکلونال ضدفیبرین متصل کرده ، کمپلکس حاصل به لخته خونی متصل و لخته ها را بدون کاهش زیاد فیبرینوژن تخریب کرد .

35. آزاد شدن دارو در مجاورت سلولهای هدف بوسیله Abمونوکلونال • برای حصول اطمینان از اینکه دارو فقط در مجاورت سلولهای هدف آزاد می شود ، آن را به یک Ab مونوکلونال که بر ضد Ag های سطح سلولی خاصی عمل می کند متصل می نماییم . • اگر بخواهیم این شکل از سیستم درمانی موثر باشد لازم است Ab مونوکلونال که به یک آنزیم مبدل پیش دارو متصل شده 1. به صورت نسبتاً خالص و در مقادیر بالا در دسترس باشد تا بتواند به یک پروتئین فوق العاده اختصاصی برای سلول هدف متصل شود . • 2. این Abباید در شرایط فیزیولوژیکی پایداری لازم را داشته باشد. • 3.به سرعت از جریان خون حذف شود .4. هنگام لزوم قادر به نفوذ در توده های توموری باشدتا تمام سلولها در معرض دارو قرار گیرد .

36. تولید Ab مونوکلونال علیه پروتئین پوششی نو ترکیب ویروس عامل بیماری ریزومانیای چغندرقند • بیماری ریزومانیا یکی از مهم ترین بیماری های چغندرقند می باشد .عامل این بیماری ویروس زردی نکروتیک رگبرگ چغندرقند (BNYVV) است که ناقل آن شبه قارچ PolymyXabetaekeskin می باشد . در این پژوهش سلولهای هیبریدومای پایدار مولد Abمونوکلونال علیه پروتئین پوششی نوترکیب ویروس BNYVV توسط امتزاج سلولهای طحال موش و سلولهای سرطانی میلوما حاصل گردیدند.Abهای حاصل به خوبی قادر به تشخیص ریشه های آلوده به BNYVV می باشند .

37. تولید Ab مونوکلونال علیه پروتئین پوششی نو ترکیب ویروس عامل بیماری ریزومانیای چغندرقند

38. Refrences • کتاب بیولوژی مولکولی (اصول و کاربرد DNAنوترکیب ) جلد 1 و 2 ،تالیف : برناد آرگیک ، جک جی پاستونک • فصلنامه باروری و ناباروری علی اکبر صبوریراقی ، (دانشجوی PHD) ، رویاقدس (M.SC)، فاضل شکری (PHD) • فصلنامه پزشکی اکرم سادات طباطبایی پناه (PHD) ، امیرحسن زرنانی (PHD) و... • کتاب بیوتکنولوژی ملکولی ، تالیف : دکتر سیدنی پرایمرز

39. با تشکر از توجه شما!