Etude de la variabilité du potentiel protéolytique de paroi chez Streptococcus thermophilus Caractérisation de la variab

1. L'équipe Domestication en aquaculture continentale L'équipe Micropolluants & résidus dans la chaîne alimentaire L'équipe Protéolyse & biofonctionnalités des protéines et des peptides Etude de la variabilité du potentiel protéolytique de paroi chez Streptococcus thermophilus Caractérisation de la variabilité du gène prtS Sous la direction Pr. Annie DARY et Dr. Clarisse PERRIN Wessam GALIA Ecole Doctorale RP2E 15 janvier 2009

2. Le peptide bioactif d’origine alimentaire : • ne répond pas seulement aux besoins nutritionnels • joue un rôle bénéfique chez le consommateur • rôle anxiolytique ou anti hypertensif... Production de peptides bioactifs

3. Les protéines du lait renferment dans leur séquence une grande variété de peptides potentiellement bioactifs : • par protéolyse in vitro • ajout à l’aliment • directement dans l’organisme • générés par des protéases endogènes • 2 % des gènes humains codent pour des protéases ou des inhibiteurs de protéases • pendant la fabrication / transformation de l’aliment (fermentation, affinage) • générés par des bactéries lactiques (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus ..) Production de peptides bioactifs issus du lait

4. Production de peptides bioactifs par voie microbienne • Mieux comprendre le potentiel protéolytique d’une bactérie lactique :Streptococcus thermophilus • Caractérisation du potentiel protéolytique • Caractériser les différents acteurs du système • Caractériser sa variabilité au sein de l’espèce St. thermophilus dans le but de sélectionner des souches capables de libérer des peptides bioactifs.

5. Présentation de Streptococcus thermophilus • Une des bactéries lactiques les plus utilisées dans l’industrie des ferments (du lait) • Homofermentaire et se développe entre 37 et 42°C • Appartient au genre Streptococcus • Non pathogène • Séquençage complet de 3 génomes a révélé : • - l’absence des gènes de virulence • - une faible variabilité de séquence Bolotin et al., Nature Biotechnology (2004) 22:1554-1558

6. Variabilité phénotypique chez St. thermophilus Variabilité phénotypique affecte différents caractères tels que : - morphologie des colonies, - taille des chaînettes, - résistance à différents stress, - vitesse de croissance et d’acidification du lait

7. Système protéolytique de St. thermophilus Milieu extracellulaire Paroi bactérienne Cytoplasme Monnet, Bull. Soc. Fr. Microbiol (2006) 21:23-28

8. Les protéases extracellulaires • chez les bactéries lactiques Cell Wall Membrane Cytoplasme CWMC Savijoki et al., 2006Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406

9. A PR PP A PR PP A PP PR A PP PR A PP PR Domaine catalytique Prédomaine (signal+proséquence) ? • Les protéases extracellulaires • chez les bactéries lactiques Cell Wall Membrane Cytoplasme CWMC W W W W W Espaceur Savijoki et al., 2006Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406

10. AN H H AN AN H Positionnement de A et B Ancrage • Les protéases extracellulaires • chez les bactéries lactiques Cell Wall Membrane Cytoplasme CWMC Savijoki et al., 2006Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406

11. Caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385 • Protéase de 169 kDa et de 153 kDa après maturation • Appartient à la famille des protéases à sérine, famille des subtilisines • Capable d’hydrolyser les caséines S1 et  • Gène de 4755 pb, exprimé en conditions de carence azotée • Régulation du gène prtS est inconnue Fernandez-Espla et al., AEM (2000)

12. Caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385 • Protéase de 169 kDa et de 153 kDa après maturation • Appartient à la famille des protéases à sérine, famille des subtilisines • Capable d’hydrolyser les caséines S1 et  • Gène de 4755 pb, exprimé en conditions de carence azotée • Régulation du gène prtS est inconnue Fernandez-Espla et al., AEM (2000) • Activité protéolytique de surface retrouvée uniquement chez quelques souches • Shahbal et al., AEM (1993)

13. Démarche expérimentale • Evaluer la variabilité génétique d’une collection de souches de St. thermophilus • Evaluer la variabilité du potentiel protéolytique de surface de St. thermophilus

14. ITS 16S-23S Gène ARNr 16S Gène ARNr 23S ITS-I AAGGCCAAAAATAA ITS-III ..........T... ITS-IV ...A.......... ITS-V ...A......T... ITS-II ..........-... Consensus..........t... ITS-I AAGGCCAAAAATAA ITS-III ..........T... ITS-IV ...A.......... ITS-V ...A......T... ITS-II ..........-... Mise en évidence d’un nouveau type ITS-V • Génotypage de souches de St. thermophilus • Séquençage de la région Internal Transcribed Spacer 16S-23S (Galia et al., 2009)

15. Génotypage de souches de St. thermophilus Mise en évidence d’une variabilité génétique au sein de la collection de souches de St. thermophilus

16. Présence de la protéase de surface Forte croissance = fort pouvoir acidifiant Absence de la protéase de surface Faible croissance = faible pouvoir acidifiant • Variabilité du système protéolytique de surface Détermination de l’acidité Dornic (acide lactique produit) permet d’évaluer la croissance d’une souche en milieu lait

17. Variabilité du système protéolytique de surface après 6 h de croissance en lait (° Dornic) 12 Souches à fort pouvoir acidifiant 53,4 ± 4,5°D 2 Souches à faible pouvoir acidifiant 11,0 ± 2,4°D 16 Souches à moyen pouvoir acidifiant 29,8 ± 4,2°D Variabilité du système protéolytique de surface ?

18. Variabilité du système protéolytique de surface • Recherche du gène prtS 800 pb Souches à fort pouvoir acidifiant 12/12 souches posséderaient le gène prtS Souches à faible pouvoir acidifiant 2/2 souches ne possèdent pas le gène prtS Souches à moyen pouvoir acidifiant 11/16 souches posséderaient le gène prtS 5/16 souches ne possèdent pas le gène prtS

19. LMD9 CNRZ1066 • Variabilité du système protéolytique de surface • Recherche de l’activité de la protéase PrtS par zymographie PB18o PrtS

20. Variabilité du système protéolytique de surface • Recherche de l’activité de la protéase PrtS par zymographie pour toutes les souches PrtS

21. Variabilité de l’activité protéolytique de surface • Pourquoi ? Gène prtS muté Gène prtS non exprimé Séquençage du gène prtS chez : • 4 souches à moyen pouvoir acidifiant (prtS+ PrtS-) • 3 souches à fort pouvoir acidifiant (prtS+ PrtS+) Comparaison de séquences : • 100% identiques entre elles et avec la souche LMD-9 • 95% identiques avec la souche CNRZ385

22. fonction inconnue Région fixation du substrat PB18o ou LMD9720VQNGLITLAPRLLAEIPGGKVTVQ743 CNRZ 385688AQKRIDHLGSTSISRDSWRKVTVK711 PB18o ou LMD9936SGNKNFYSGDP946 CNRZ 385904SGDKNIYSGNP914 PB18O OU LMD960SESPVAEELVDTSVEATSTDVTTTDNEEETLGSESPVVEELVDTSVEATPTDVTTTDNVEETLGSE126 CNRZ38560--------------------------------SESPVVEELVDTSVEATSTDVTTTDNEEETPGSE94 • Variabilité du système protéolytique de surface Séquençage du gène prtS : • SS PP PR A H W AN • PB18o ou LMD9 1 36 177 492 1110 1477 1583 1618 • CNRZ 385 1 36 145 460 1077 1444 1550 1585 PB18o Moyen pouvoir acidifiant LMD9 Fort pouvoir acidifiant

23. Variabilité du système protéolytique de surface Séquençage du gène prtS : Région fixation du substrat PB18o ou LMD9936SGNKNFYSGDP946 CNRZ 385904SGDKNIYSGNP914 PB18o Moyen pouvoir acidifiant LMD9 Fort pouvoir acidifiant

24. Conclusion Variabilité du système protéolytique de surface - Variabilité en terme de présence / absence du gène prtS - 2 allèles prts différents ont été mis en évidence chez S. thermophilus Variabilité affecte la régulation du gène

25. Perspectives : - Etude de la régulation du gène prtSentre - les souches qui ont le gène et qui l’expriment fortement - et les souches qui ont le gène et qui l’expriment peu ou pas.