ĆELIJSKE KULTURE

1. ĆELIJSKE KULTURE

2. ŠTA JE ĆELIJSKA KULTURA ? KULTURA ORGANA, KULTURA TKIVA – održavanje celih organa ili fragmenata tkiva u in vitro uslovima, uz očuvanje međućelijskih veza kakve postoje in vivo. KULTURA ĆELIJA – održavanje određenog tipa ćelija izolovanih iz odgovarajućeg organa/tkiva u in vitro uslovima.

3. ZAŠTO GAJITI ĆELIJE U KULTURI ? • Ispitivanje normalne ćelijske fiziologije i biohemije Npr. ispitivanje metaboličkih puteva praćenjem produkata razgradnje radioaktivno obeležene supstance • Testiranje efekata različitih jedinjenja na određeni tip ćelija • Npr. metaboliti, faktori rasta, hormoni, potencijalno toksične ili mutagene supstance, lekovi ... • Produkcija veštačkog tkiva kombinovanjem specifičnih tipova ćelija • Npr. potencijalno značajan način za formiranje “veštačke kože” u tretmanu opekotina

4. ZAŠTO GAJITI ĆELIJE U KULTURI ? • Sinteza korisnih, komercijalno značajnih bioloških produkata • Npr. Proteini koji su in vivo u ćeliji prisutni u minimalnim količinama, mogu se gajenjem ćelija in vitro proizvesti u količinama koje se mere gramima, pa i kilogramima (primena u biotehnologiji)

5. ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ? • STERILNI USLOVI • LAMINAR (hood, biosafety flow cabinet)

6. ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ? • INKUBATOR - održavanje esencijalnih parametara na nivoima optimalnim za očuvanje ćelijske kulture i vijabilnost ćelija • temperatura - obično 37C za sisarske ćelije • vlažnost vazduha – sprečava isparavanje medijuma • CO2 – najčešće 5%, održavanje pH medijuma

7. ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ? • POSUDE ZA GAJENJE ĆELIJA U KULTURI Flaskovi – najčešće polistirenski, sa površinom adaptiranom za prijanjanje i rast ćelija Petri ploče

8. ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ? Mikrotirar ploče (multi-well plates) – 96-, 48-, 12-, 6 – well ploče

9. ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ? Spinner bottles/flasks – staklene boce, sa centralnom teflonskom drškom sa magnetom; gajenje ćelija u suspenziji Roller bottles – plastične boce; ćelije prijanjaju za celu unutrašnju površinu

10. ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ? Cell factory

11. ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ? • MIKROSKOPI Standardni Inverzni

12. ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ? • CENTRIFUGE • KONTEJNERI SA TEČNIM AZOTOM

13. KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ? • PRIMARNA ĆELIJSKA KULTURA ćelije se izoluju direktno iz životinje, i gaje u medijumu mehanička izolacija – izvodi se presovanjem tkiva kroz filtere, procedura brza, ali visok stepen mehaničkog oštećenja ćelija  enzimatska disagregacijatkiva do pojedinačnih ćelija – koriste se proteolitički enzimi, npr. tripsin ili kolagenaza

14. KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ? U zavisnosti od organa iz kog se ćelije izoluju, primenjuju se različite eksperimentalne procedure: - perfuzija organa rastvorom enzima - inkubacija delova organa/tkiva u rastvoru enzima VAŽNO! Obezbediti što kraći kontakt tkiva i proteolitičkog enzima! Tripsin – 10-20 min; duže izlaganje može da izazove oštećenje membrane Kolagenaza – manje destruktivna na nivou ćelijske membrane, ali takođe zahteva brzo uklanjanje iz sistema

15. KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ? Po završetku inkubacionog vremena/perfuzije, reakcija se prekida dodavanjem hladnog medijuma ! disagregacija tkiva i resuspendovanje ćelija praćeno uklanjanjem proteolitičkog enzima iz sistema brojnim ispiranjima i centrifugiranjem ćelija KRAJNJI CILJ: 1.dobijanje “što čistijeg” preparata, tj. sa što manjim brojem drugih ćelija koje su sastavni deo tkiva iz kog se vrši izolacija - tokom izolacije – centrifugiranjem na gradijentu, - selektivnim gajenjem – postiže se odgovarajućim sastavom medijuma 2. zadovoljavajuća vijabilnost ćelija

16. KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ? Nakon izolacije, određuje se broj ćelija u dobijenoj suspenziji, i pravi se suspenzija iz koje se ćelije sade u odgovarajuće ploče. Potreban period za oporavak ćelija od izolacije i prijanjanje za podlogu, (2-24h) ! Tek nakon toga radi se tretman ćelija i sl... Primarne ćelijske kulture imaju ograničen životni vek (meri se danima/nedeljama)

17. KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ? • KONTINUALNA ĆELIJSKA KULTURA Ćelije sa neograničenim kapacitetom proliferacije, tzv. “besmrtne ćelije” ! KAKO NASTAJU KONTINUALNE ĆELIJSKE LINIJE? 1.Transformacijom ćelija in vitro Različite tehnike – tretman ćelija mutagenima, virusima ili onkogenima; infekcija retrovirusima 2.Od tumorskih ćelija – kancerogeneza in vivo Npr. HeLa ćelije tumora grlića materice, Namalwa ćelije tumora limfnih žlezda i dr.

18. KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ? KOLEKCIJE ĆELIJSKIH KULTURA “Banke ćelija” – veliki izbor dobro okarakterisanih ćelijskih linija Suspenzija željenih ćelija se doprema poručiocu u zamrznutom stanju (na suvom ledu); po pristizanju u laboratoriju, ćelije se odmrzavaju i počinje kultivacija Uz ćelije, dobija se i katalog sa svim potrebnim informacijama vezanim za uslove gajenja i “istoriju” date ćelijske linije

19. KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ? Najveće i najpoznatije kolekcije, sa preko 3000 dobro okarakterisanih ćelijskih linija: The American Type Culture Collection (ATCC), USA www.atcc.org The European Collection of Animal Cell Culture (EACC), UK www.ecacc.org

20. KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ? • MEDIJUM Kompleksan rastvor, sadrži različite komponente potrebne za normalan rast i metaboličku aktivnost ćelija. Vrsta medijuma koja se koristi – specifično za svaku ćelijsku liniju Tečni medijumi – (kupuje se napravljen, sterilan rastvor i kao takav se koristi)

21. KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ? Medijumi u prahu - prema odgovarajućoj recepturi, pravi se rastvor, podešava pH, i obavezno se steriliše filtriranjem kroz filter sa porama veličine 0.22µm.

22. KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ? STANDARDNE KOMPONENTE MEDIJUMA • Ugljeni hidrati – najčešće glukoza kao osnovni izvor energije; riboza kao prekursor za sintezu nukleinskih kiselina; fruktoza • Aminokiseline – 0.1-0.2mM, kao prekursori za sintezu proteina; Glutamin: 2-4mM, prekursor intermedijera u TCA ciklusu; • Soli – izotoničnost rastvora • Vitamini i hormoni – u malim koncentracijama (µmol), kao metabolički ko-faktori; udeo i vrsta izuzetno variraju u zavisnosti od vrste medijuma tako da odgovaraju zahtevima ćelijskih linija za koje se dati medijum koristi

23. KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ? • Supstance za održavanje pH rastvora: • Bikarbonati (NaHCO3) – u kombinaciji sa CO2 u atmosferi (5-10%), omogućuje se održavanje pH na 6.9-7.4. Nedostatak: po vađenju iz inkubatora, pH može naglo da poraste • HEPES4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid )– 10-20mM; može da spreči porast pH; ćelije mogu da se gaje i u atmosferi bez CO2 • Phenol red – indikator pH, osetljiv na vrlo male promene pH (okvirno: pH 6.5- žut, pH 7.0 – narandžast, pH 7.4 – crven, pH 7.8 – ljubičast medijum), postoje i formulacije bez ove komponente (takvi medijumi su bezbojni rastvori)

24. KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ? DODACI MEDIJUMU • Serum – sadrži faktore rasta, neophodne za bolji rast i proliferaciju ćelija u kulturi Najčešće se koriste fetalni teleći (fetal calf/bovine serum – FCS, FBS) ili konjski serum (fetal horse serum), zbog vrlo visokog sadržaja embrionalnih faktora rasta, zatim teleći serum dobijen od životinje stare 10 dana (newborn calf serum), teleći serum dobijen od životinje stare manje od 8 meseci (donor calf serum). • Udeo u medijumu najčešće 10% ili 5% • kupuje se kao sterilan, testiran na prisustvo mikroorganizama i nekih hemijskih jedinjenja

25. KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ? • Antibiotici – smanjuju rizik od kontaminacije Penicilin (~ 100 IU/ml) – inhibira rast Gram+ bakterija Streptomicin (~ 50-100 mg/l) – inhibira rast Gram+ i Gram- bakterija Amfotericin (~25 mg/l) – antifungalni agens

26. KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ? • PRAĆENJE ĆELIJSKE KULTURE ODREĐIVANJE BROJA ĆELIJA U radu sa primarnim kulturama – određivanje broja izolovanih ćelija, određivanje vijabilnosti ćelijapravljenje suspenzije za sađenje sa odgovarajućim brojem ćelija,... U radu sa kontinualnim kulturama – praćenje rasta i proliferacije ćelija, “pasažiranje” ćelija, pravljenje suspenzije za sađenje sa odgovarajućim brojem ćelija, ...

27. srednja vrednost broja ćelija u A-kvadratima Broj ćelija/ml = x Razblaženje x 10 000 broj živih ćelija % vijabilnosti = x 100 ukupan broj ćelija Trypan Blue Exclusion Test – TBE Test Neuber-ova komora suspenzija ćelija + trypan blue (R) Brojanje ćelija u A-kvadratima Neuber-ove komore Žive ćelije – neobojene Mrtve ćelije - obojene plavo

28. ... ~24h Medijum se odliva, ćelije se ispiraju rastvorom tripsina dok se ne odlepe, broje se, i određeni broj prebacuje se u novi flask u kome će nastaviti svoju proliferaciju KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ? KONTINUALNE LINIJE – PASAŽIRANJE ĆELIJA U zavisnosti od dinamike rasta ćelija i broja ćelija koji se pasažira, pasažiranje se obično radi jednom nedeljno. Obavezna zamena medijuma svežim, svaka 2-3 dana !

29. KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ? PROBLEM: KONTAMINACIJA Vreme za koje se udvostruči broj ćelija: sisarske ćelije ~24h bakterijske ćelije ~30min - prepoznaje se po promeni boje i/ili zamućenju medijuma - bakterije, plesni, mikoplazma ŠTA URADITI ? - Kontaminirane kulture što pre ukloniti iz laboratorije, da kontaminacija ne zahvati zdrave linije - U pojedinim slučajevima (npr. pri kontaminaciji mikoplazmom) moguće je “lečenje” kulture odgovarajućom kombinacijom antibiotika - Identifikacija i eliminacija izvora kontaminacije

30. VAŽNO! Ovo su bile neke osnovne informacije o radu sa ćelijskim kulturama. Potrebno je stalno imati na umu da je svaka ćelijska linija priča za sebe, sa svojim posebnim zahtevima i specifičnostima, koje je potrebno dobro upoznati i proučiti kako bi gajenje u kulturi bilo uspešno.