Принципы генной терапии

1. Принципы генной терапии автор - к.б.н. Лазарев В.Н."

2. Принципы генной терапии Молекулярная медицина Генная диагностика Генная терапия

3. Принципы генной терапии Генная терапия -новая область современной биомедицины, основанная на введении в организм больного рекомбинантных генетических конструкций с лечебной целью.

4. 14 сентября 1990 г. - введение ретровирусного вектора, экспрессирующего ген аденозиндеаминазы (ADA) (частота встречаемости 1:100 000) двум больным, страдающим комбинированным иммунодефицитом ADA-SCID (недостаточность аденозиндеаминазы) (National Institute of Health (NIH), Bethesda, USA)

5. Принципы генной терапии

6. Принципы генной терапии • Классификация генной терапии • 1) по типу клеток-мишеней: • соматическая • фетальная

7. Принципы генной терапии • Классификация генной терапии • 2) по цели воздействия: • позитивная ( компенсация экспресcии гена) • негативная (подавление функций гена)

8. Принципы генной терапии • Классификация генной терапии • 3) по тактике введения генотерапевтического агента: • ex vivo ( клетки крови) • in situ (локально) • in vivo (системное введение) • in utero (введение конструкций в эмбрион)

9. Принципы генной терапии • Классификация генной терапии • 4) по типу векторной системы: • вирусные векторы • невирусные векторы • микроинъекция • “gene gun” (генный пистолет)

10. Принципы генной терапии • Классификация генной терапии • 5) по применяемым агентам: • нуклеиновые кислоты • белки • иммунотерапия

11. Классификация генной терапии по типу клеток-мишеней по типу векторной системы по типу агента по тактике введения агента по цели воздействия нуклеиновые кислоты невирусные векторы ex vivo (клетки крови) in vivo (системно) вирусные векторы in utero (эмбрион) соматическая позитивная in situ (локально) фетальная негативная иммунотерапия генное ружье микроинъекция белки

12. Принципы генной терапии • Смена парадигм генной терапии • от «генетической» к генной терапии • от «пересадки» генов к пересадке клеток • от вирусных к невирусным векторам

13. Принципы генной терапии Генотерапевтические агенты

14. Нуклеиновые кислоты – генотерапевтические агенты • Антисенс ДНК и РНК • Рибозимы • Peptide – nucleic acids (PNA) • РНК - ловушки

15. Антисенс ДНК и РНК

16. Антисенс ДНК и РНК • Преимущества: • относительная специфичность дуплекса • возможность экспрессии в составе любого вектора • отсутствие иммуногенности • Недостатки: • быстрая деградация (РНКазы, ДНКазы) в клетке

17. Рибозимы • Типы: • Головка молотка • Шпилька • Интроны группы I, II Сайт расщепления NUY N – любой нуклеотид Y – любой, кроме G

18. Рибозимы • Преимущества: • каталитические свойства (расщепление мишени) • в процессе взаимодействия с мишенью молекулы не расходуются (ингибирование экспрессии гена – мишени при низких концентрациях) • отсутствие иммуногенности • индукция интерферона • Недостатки: • быстрая деградация (РНКазы, ДНКазы) в клетке • Возможно создание модифицированных рибозимов

19. Peptide – nucleic acids (PNA) • Дуплексы DNA/PNA более стабильны, чем дуплексы DNA/RNA • Дуплексы DNA/PNA не подвержены действию RNase H, протеаз, пептидаз

20. РНК - ловушки Гиперэкспрессия коротких РНК (РНК – ловушки), направленных на cis – активаторные регуляторные элементы, могут использоваться как ловушки для trans – активаторных белков. Механизм действия - блокирование связывания трансактиваторных белков вируса с регуляторными элементами

21. Белки – генотерапевтические агенты • Трансдоминантные негативные белки • Одноцепочечные антитела (intrabodies) • Суицидные гены

22. Трансдоминантные негативные белки Трансдоминантные негативные белки – мутантная версия регуляторных или структурных белков • Механизм действия: • Конкуренция за субстраты и кофакторы • Образование нефункциональных мультимерных комплексов

23. Трансдоминантные негативные белки • Преимущества: • возможность использования в составе невирусных векторов • Недостатки: • иммуногенность • Использование в качестве ТНБ клеточных (невирусных) белков

24. Одноцепочечные антитела Новый класс генотерапевтических агентов. Одноцепочечные вариабельные фрагменты антител с сохраненными свойствами антиген-специфичности, получаемые клонированием и экспрессией генов легких и тяжелых цепей антител А) Вариабельные домены тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей (около 110 а.а.) B) Домены соединены гибким линкером (глицин(4)-серин(3)) C) Использование домена Ck легкой цепи разрешает димеризацию – увеличение активности и стабильности

25. Одноцепочечные антитела • Преимущества: • возможность экспрессии в гетерологичных системах • сохранение всех свойств классических антител • Недостатки: • отсутствие возможности к секреции (связаны с эндоплазматической сетью) • Использование сигнальных последовательностей позволяет одноцепочечным антителам секретироваться

26. Суицидные гены Вместо ингибирования (или компенсации)функции дефектного гена возможно использование суицидных генов, экспрессия которых вызывает гибель клетки-мишени • Примеры: • А-цепь дифтерийного токсина • ген цитозиндеаминазы • ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV tk)

27. Суицидные гены

28. Суицидные гены • Bystander effect • («эффект свидетеля» • Распространение токсичных продуктов фосфорилирования GCV через межклеточные щелевые контакты • Индукция специфического иммунитета • Фагоцитоз апоптических везикул, содержащих метаболиты GCV Результат - гибель соседних клеток (генная терапия опухолей)

29. Суицидные гены Экспрессия гена HSV tk (в виде составного белка с GFP) приводит к гибели клеток по механизму апоптоза

30. Иммунотерапия • ДНК – вакцины • Антиген – специфичные Т лимфоциты

31. ДНК - вакцины • Плазмидный вектор для экспрессии HBs антигена • Способы введения: • Внутрикожно • Подкожно • Внутримышечно • ? Внутривенно

32. ДНК - вакцины • Преимущества: • дешевизна производства • отсутствие иммуногенности (? Анти-ДНК антитела) • экспрессия продукта гена в нативной форме • индукция Т-клеточного иммунитета • Недостатки: • низкая эффективность доставки • низкая емкость векторов • высокая вероятность интеграции в геном клетки

33. Принципы генной терапии Знаем: что лечить Знаем: чем лечить Не знаем: КАК ЛЕЧИТЬ?

34. Принципы генной терапии Системы доставки генетического материала

35. Системы доставки генетического материала Векторы вирусные невирусные

36. Системы доставки генетического материала • Вирусные векторы: • ретровирусы • аденовирусы • аденоассоциированный вирус • герпесвирусы • лентивирусы • и др.

37. Системы доставки генетического материала • Вирусные векторы • - достоинства: • трансфекция большого количества клеток • тропизм • неспособность реплицироваться в клетке-хозяине • устойчивость к деградации лизосомами

38. Системы доставки генетического материала • Вирусные векторы • - недостатки: • иммуногенность (аденовирусы, герпесвирусы) • потенциальная туморогенность (ретровирусы)

39. Системы доставки генетического материала Аденовирусы

40. Аденовирусы • Преимущества: • способны инфицировать неделящиеся клетки • большая клонирующая емкость (в настоящее время - до 28 т.п.о.) • низкая вероятность встраивания в геном клетки-мишени • относительная простота производства • высокий титр при продукции в пермиссивных клеточных линиях

41. Аденовирусы • Недостатки: • ИММУНОГЕННОСТЬ ( иммунный ответ развивается через 2-3 инъекции) • транзиентная экспрессия целевых генов

42. Аденовирусные векторы 0 17 9 100 трансген трансфекция Е1 лизис Хромосома клетки - хозяина 0 17 трансген 9 100 трансген

43. Системы доставки генетического материала Ретровирусы

44. Ретровирусы • Преимущества: • не иммуногенны • постоянная экспрессия целевых генов

45. Ретровирусы • Недостатки: • инфицируют только делящиеся клетки • потенциальная туморогенность • низкий титр • небольшая клонирующая емкость (около 3.5 т.п.о.)

46. Жизненный цикл ретровирусов • инфицирование клетки-мишени • синтез ДНК-копии генома с помощью обратной транскриптазы • транспорт вирусной ДНК в ядро • встраивание вирусной ДНК в хромосому клетки • транскрипция мРНК с вирусной ДНК под контролем 5`-LTR промотора • трансляция белков Gag, Pol, Env в цитоплазме • образование вирусного капсида и упаковка двух цепей РНК и обратной транскриптазы • высвобождение вирионов из клетки

47. Жизненный цикл ретровирусов

48. Интеграция

49. Ретровирусные векторы + gag 5`-LTR 3`-LTR + pol env Трансфекция продуцирующей линии клеток 5`-LTR 3`-LTR Упакованная РНК Пакующая клеточная линия + Ген X neo 5`-LTR 3`-LTR Плазмидный вектор с пакующим сигналом

50. Системы доставки генетического материала Невирусные системы