第十三章高效毛细管电泳法

第十三章高效毛细管电泳法 电泳是溶液中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象。利用这种现象对化学和生物化学组分进行分离分析的方法称之为电泳法。传统电泳最大的局限性是难以克服由两端的高电压所引起的电介质离子流的自热，或称焦耳热, 从而导致区带展宽，影响迁移，降低效率, 因此极大地限制了高压的使用.当然也就难以加快整个过程的速度。

毛细管电泳（ capi1lary electrphoresis，CE）和传统电泳的根本区别在于前者设法使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，从而确保引入高的电场强度，全面改善分离质量。 20世纪30－40年代蒂塞利乌斯(A.W.K.Tiselius）建立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术获得1948年诺贝尔化学奖

l967年Hjerten最先提出在高电场强度，直径为3mm的毛细管中作自由溶液的毛细管区带电泳，开创了CE的先河。l967年Hjerten最先提出在高电场强度，直径为3mm的毛细管中作自由溶液的毛细管区带电泳，开创了CE的先河。 • 1981年，J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。 • 1988~89年，商品化的毛细管电泳仪推出，毛细管电泳法迅速发展起来。第一节毛细管电泳的特点和分类一、电泳和色谱 1.分离原理

电泳是溶液中带电粒子在电场力作用下发生定向运动，因粒子所带电荷数、形状、大小等不同，导致不同的迁移速度而分离。色谱是不同组分在流动相的推动下，由于在固定相流动相中的分配系数不同，导致不同的迁移速度而分离。但某些毛细管电泳的分离模式也包含了色谱的分离机制。电泳是溶液中带电粒子在电场力作用下发生定向运动，因粒子所带电荷数、形状、大小等不同，导致不同的迁移速度而分离。色谱是不同组分在流动相的推动下，由于在固定相流动相中的分配系数不同，导致不同的迁移速度而分离。但某些毛细管电泳的分离模式也包含了色谱的分离机制。 2.分离过程电泳和色谱的分离过程都是差速迁移过程，可用相同的理论来描述。色谱中所用的一些名词概念和基本理论，如保留值、塔板理论、速率理论等均可借用于毛细管电泳中。

3.仪器流程

色谱仪和电泳仪（HPLC和CE），都包括进样部分、分离柱、检测器和数据处理等。色谱仪和电泳仪（HPLC和CE），都包括进样部分、分离柱、检测器和数据处理等。二、毛细管电泳的特点 1. 柱效高高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。 2.消耗低 CE所需样品为nl级, 流动相用量也只需几毫升, 而HPLC所需样品为μl级, 流动相则需几百毫升乃至更多。

3.速度快 一般几十秒至十几分，最多半小时，即可完成一个试样的分析。 4.应用广泛通过改变操作模式和缓冲液的成分，CE有很大的选择性，可以根据不同的分子性质，对极广泛的对象进行有效的分离。 CE分离有机分子、药物分子，特别是手性分子和生物大分子方面的能力，对HPLC地位提出了严峻的挑战。

三、毛细管电泳的分类 按分离模式分类，常用的ＣＥ技术有六种：毛细管区带电泳，胶束电动毛细管色谱，毛细管凝胶电泳，毛细管等电聚焦，毛细管等速电泳，毛细管电色谱毛细管区带电泳是CE中最基本、应用最普遍的一种模式。第二节基本原理一、电泳和电泳淌度 1. 电泳与电泳速度

在一定电场强度作用下，溶质带电粒子在溶液中的定向移动（迁移），这种现象称为电泳。带电粒子在电场中迁移时，所受的电场力为在一定电场强度作用下，溶质带电粒子在溶液中的定向移动（迁移），这种现象称为电泳。带电粒子在电场中迁移时，所受的电场力为 q: 溶质离子所带的有效电荷 E: 电场强度带电粒子在溶液中运动时受到的阻力即摩擦力为是电泳速度

f为摩擦系数，其大小与带电粒子的大小、形状以及介质粘度有关。对于球形离子，f = 6πηγ；对于棒状离子，f = 4πηγ。式中，γ是溶质离子的动力学半径，η是电泳介质的粘度。平衡时，电场力和摩擦力相等，即 qE = fvep 电泳速度为

不同物质在同一电场中，由于它们的有效电荷、形状大小的差异，它们的电泳速度不同，所以可能实现分离 2．电泳淌度　我们把溶质在给定溶液中和单位电场强度下的电泳速度称为电泳淌度，用μep表示。

在一定条件下，不同粒子的形状、大小以及所带电量都可能有差别，则电泳淌度也可能不同。在一定条件下，不同粒子的形状、大小以及所带电量都可能有差别，则电泳淌度也可能不同。溶质粒子的电泳速度决定于粒子淌度和电场强度的乘积， vep＝μepE 所以淌度不同是电泳分离的内因和前提。（1）绝对淌度（μab）是在无限稀释时单位电场强度下离子的平均迁移速度，它是该离子在一定溶液中的一个特征物理常数。

（2）有效淌度（μef） 我们不可能在无限稀释而又没有其它离子、酸度等影响下进行工作，有效淌度是实际的离子电泳淌度。（3）表观淌度（μap）在有电渗存在下，测得的实际离子淌度称为表观淌度或净淌度，是电泳淌度μep和电渗淌度μos的矢量和。 μap=μos±μep

二、电渗和电渗流 1．电渗现象　当固体与液体相接触时，如果固体表面因某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带相反电荷，当液体两端施加一定电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种现象叫做电渗。

高效毛细管电泳大多使用石英毛细管，在内充缓冲液PH>2时，管壁的硅醇基（－SiOH）离解成硅醇基阴离子（－SiO－），使管壁带负电荷，溶液带正电荷，在管壁和溶液之间形成双电层。高效毛细管电泳大多使用石英毛细管，在内充缓冲液PH>2时，管壁的硅醇基（－SiOH）离解成硅醇基阴离子（－SiO－），使管壁带负电荷，溶液带正电荷，在管壁和溶液之间形成双电层。 Zeta电位

由于溶液中的阳离子实际上是溶剂化的，在外电场的作用下，溶剂化的阳离子向负极移动，将引起柱中的溶液整体向负极移动，这就是毛细管电泳中的电渗现象。由于溶液中的阳离子实际上是溶剂化的，在外电场的作用下，溶剂化的阳离子向负极移动，将引起柱中的溶液整体向负极移动，这就是毛细管电泳中的电渗现象。 2。电渗流（electroosmotic flow，EOF）电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流。

3. 电渗流的大小和方向 电渗流的大小用电渗流速度vos表示，其大小决定于电渗淌度μos和电场强度E。即 ε、η－分别是电泳介质的介电常数和粘度, ζ－毛细管壁的Zeta电位，它近似等于扩散层与紧密层界面上的电位。该界面内净电荷数（正电荷数）越多、扩散层越厚，Zeta电位越大.

VOS可通过实验测定 Lef—毛细管有效长度； tos—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。电渗流的速度是电泳速度的5～7倍。一般情况下，石英毛细管内壁表面带负电荷，则电渗流带正电荷，向负极移动。但如果将毛细管内壁改性，比如在在内壁表面涂渍或键合一层阳离子表面活性剂，将使壁表面带正电荷，则电渗流带负电荷，向正极移动。

4.电渗流的流形 在外电场驱动下产生的电渗流为平流，即塞式流形。液体流动速度除在管壁附近因摩擦力迅速减小到零以外，其余部分几乎处处相等。这一点和HPLC中靠泵驱动的流动相的流形完全不同。

HPLC流动相的流形为抛物线形的层流，在管壁处的速度为零，管中心的速度是平均速度的2倍，引起的谱峰展宽较大。电渗流呈平流，引起的谱峰展宽很小，是毛细管电泳能获得较HPLC更高分离效率的重要原因。 4. 电渗流的作用电渗流通常流向负极，电渗流速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍。所以，各种电性物质在毛细管中的迁移速度为两种速度的矢量和，称为表观电泳速度，用vap表示。

vap=μapE=(μos±μep)E 阳离子： vap＝vos+vep 阴离子： vap＝vos－vep 中性分子： vap＝vos 当把试样从阳极端注入到毛细管内时，不同电性的粒子将按不同的速度向负极迁移，从负极端先后流出毛细管。出峰次序是：阳离子>中性分子>阴离子中性分子与电渗流速度相同，不能互相分离。

电渗流在HPCE 的分离中起着极其重要的作用： ①电渗流具有像HPLC中泵一样的作用，推动离子前进，加上不同离子电泳速度和方向的差异，完成阳离子、阴离子和中性离子的分离。 ②改变电渗流的大小和方向，可以改变分离效率和选择性。这是HPCE中优化分离的重要因素。 ③电渗流的微小变化影响分离结果的重现性（迁移时间和峰面积）。电泳中影响电渗流的因素很多，应设法控制电渗流的恒定。

三、HPCE中影响电渗流的因素 1.电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。 2.毛细管材料的影响酸度影响毛细管的表面Si-OH基的电离，特别是在pH4～7范围内，影响更显著，此时溶液pH值与EOF成近线性关系

3. 电解质溶液性质的影响 （1）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大； pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）缓冲液阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。

（3）缓冲液浓度（离子强度）的影响 缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液粘度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液浓度增加，离子强度增加，电渗流下降。

4. 温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的粘度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热” 焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1度，将引起背景电解质溶液粘度变化2%～3%；

5. 添加剂的影响 （1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向某些阳离子表面活性剂使电渗流减小，某些阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，电渗流增大（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使溶液的粘度减小，电渗流增大。

四、柱效和分离度 （一）理论塔板数和塔板高度用理论塔板数n和塔板高度H表示柱效。n可以直接由电泳图求出 tm为起点到谱峰最高点所对应的时间，称为迁移时间。因为毛细管中，没有固定相，不存在组分在固定相中分配和保留。

塔板高度H为： Lef为进样口到检测器的距离, 为有效柱长.检测器在柱上，Lef<L （二）谱带展宽 1. 纵向扩散在理想的情况下，纵向扩散是HPCE中导致谱带展宽的唯一因素。根据范第母特方程 D是溶质组分的扩散系数

纵向扩散与扩散系数成正比，与表观电泳速度成反比。Vap小，tm长，谱峰展宽。纵向扩散与扩散系数成正比，与表观电泳速度成反比。Vap小，tm长，谱峰展宽。若只考虑纵向扩散，则理论塔板数为 V是电压，L是毛细管全长。由上式可知，n与电场强度E（或电压V）成正比，与溶质的扩散系数成反比。大分子比小分子扩散系数小，可以获得更高的分离效率。

在HPCE中，溶质在几万至十几万伏的电压下，迁移速度较快，纵向扩散小，柱效高。在HPCE中，溶质在几万至十几万伏的电压下，迁移速度较快，纵向扩散小，柱效高。在实际电泳过程中，出了溶质的纵向扩散外，还存在很多引起谱峰展宽的因素，如焦耳热、吸附等。 2. 焦耳热电流通过毛细管内缓冲溶液时产生自热，称焦耳热。焦耳热通过管壁向周围环境散热，管中心温度最高，由中心向管壁温度逐渐下降。温度高粘度小，因而管中心的迁移速度最快，管壁附近的迁移速度最慢，破坏了溶质带的扁平流轮廓，导致溶质区带展宽。

小内径毛细管散热面积大，温度梯度小，谱峰展宽小。但是，内径过细会带来检测、进样等方面的一系列困难，又易造成柱的堵塞。因此目前采用的多是内径25～75μm柱子。小内径毛细管散热面积大，温度梯度小，谱峰展宽小。但是，内径过细会带来检测、进样等方面的一系列困难，又易造成柱的堵塞。因此目前采用的多是内径25～75μm柱子。采用低淌度缓冲液，如Tris [三-（羟基甲基）氨基甲烷]等。这种粒子的质荷比很大，可以减小工作电流。采用温度控制装置，尽快除去热量，使系统尽可能地保持恒温，是目前常采用的办法。冷却温控的方法有两种，气冷和液冷，一般条件下，用气冷已可以满足要求。

3. 吸附 毛细管内壁对靠近内壁的溶质粒子的吸附，使迁移速度减慢，导致谱峰变宽。造成管内壁表面吸附的主要原因有两个: ①在电解质溶液PH大于3时，石英毛细管壁带负电荷，因静电引力溶质阳离子被管壁吸附。 ②蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，有较强的疏水作用，被极性水溶剂向管壁挤压，在PH小于3，管壁呈电中性时尤为明显。抑制或消除吸附的常用方法有：

（1）采用极端pH条件。即在低pH（2～3）或高pH（＞9）的缓冲液中进行CE分离，这样可以抑制管壁硅醇基的离解或使被分析物质带负电，与管壁相斥，吸附受到抑制。（2）对管壁内表面加以修饰（三）分离度毛细管中的分离度也用R表示，可按谱图直接由下式计算：

分离度也可表示为柱效的函数：

影响分离度的主要因素 ①工作电压V；②毛细管有效长度与总长度比； ③相邻两组分的有效电泳淌度差；④表观淌度。

第三节毛细管电泳仪 毛细管电泳仪结构比高效液相色谱仪简单。CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器等。前三个部件均易实现, 困难之处在于检测器。

一、高压电源 （1）0～30kV 稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；二、电极槽 CE的电极通常由直径0.5 ~ 1 mm的铂丝制成，电极槽通常是带螺口的小玻璃瓶或塑料瓶（1 ~ 5 mL不等），要便于密封。

三、进样系统 一般的进样方式是电动进样和压力进样。 1. 电动进样将毛细管柱的一端及其相应端的电极从缓冲池中移出，放入试样杯中，然后在一准确时间范围内施加电压，使试样因离子移动和电渗流进入毛细管柱。通过此法直接由柱头进人毛细管中的样品量Q由下式给出:

进样不均：淌度大的离子比淌度小的进样量大；进样不均：淌度大的离子比淌度小的进样量大；离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去；特别适合粘度大的试样； 2. 压力进样（1）进样端加压（2）出口端抽真空（3）虹吸进样调节进样槽和出口槽之间的相对高度使之产生虹吸作用，将样品引入

进样量与组分的淌度无关。因此，不存在上述电动进样中的歧视效应。进样量与组分的淌度无关。因此，不存在上述电动进样中的歧视效应。进样体积一般在纳升级，进样长度必须控制在毛细管总长度的1%~2%，否则将影响分离效率。

四、毛细管柱 常用弹性石英毛细管，内径50μm和75μm两种使用较多（毛细管电色谱有时用内径再大些的毛细管）。细内径分离效果好，且焦耳热小，允许施加较高电压，但若采用柱上检测因光程较短，检测限比较粗内径管要差。毛细管长度称为总长度，根据分离度的要求，可选用20～100cm长度，进样端至检测器间的长度称为有效长度。毛细管柱中充入缓冲溶液，柱的两端置于两个缓冲池中。毛细管常盘放在管架上控制在一定温度下操作。

五、检测系统 紫外-可见光分光检测、激光诱导荧光检测、电化学检测和质谱检测均可用作毛细管电泳的检测器，其中以紫外-可见光分光光度检测器应用最广。将毛细管接近出口端的外层聚合物剥去约2mm一段，使石英管壁裸露，毛细管两侧各放置一个石英聚光球，使光源聚焦在毛细管上，透过毛细管到达光电池, 实行柱上检测。六、数据处理系统与一般色谱数据处理系统基本相同。

第四节分离模式及其分离条件的选择 一、毛细管区带电泳（CZE）（一）分离原理毛细管区带电泳也称为自由溶液溶液区带电泳, 这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满，带电粒子的迁移速度是电泳和电渗流速度的矢量和。阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出。中性粒子：无电泳现象，随电渗流同行，在阳离子后流出。但不同结构的中性分子无法相互分离。

第十三章高效毛细管电泳法