ABA: Metabolismo e mecanismo de ação.

1. ABA: Metabolismo e mecanismo de ação. Cristina Filomena Justo Fisiologia Vegetal Avançada Lavras – MG 2005

2. Introdução • Ocorrência: • Em todas as plantas vasculares, na maioria dos tecidos vivos; • Em Briófitas, exceto hepáticas; • Em Fungos, como metabólito secundário. Dormina • 1949, Paul F. Wareing, • Inibidor de crescimento em gemas de batata e freixo Abscisina II • 1960, Frederick T. Addicott • Aceleração da abscisão de folhas e frutos Identidade química entre dormina e abscisina II. Consagração do termo ÁCIDO ABSCÍSICO. • A descoberta:

3. Funções Introdução (2) O ABA está relacionado com a indução de: • Dormência de gemas e sementes; • Fechamento estomático; • Inibição do alongamento da raiz principal e formação de raízes laterais; • Maturação de frutos; • Morte celular programada; • Senescência; • Síntese de proteínas de reserva em sementes; • Tolerância a stresses diversos (salinidade, frio,...); • Tolerância a dessecação; • Tuberização, etc...

4. Introdução (3) A estrutura molecular do ABA determina sua atividade fisiológica. trans cis OH 15 Carbonos Derivado isoprenóide COOH O

5. Introdução (4) Isômeros Não ocorre conversão Forma ativa de ocorrência natural Ativo na maturação de sementes; Inativo no fechamento estomático; Presente nos produtos sintéticos. Forma inativa conversível para a forma ativa [cis]; Não ocorre naturalmente; Presente nos produtos sintéticos

6. Via indireta Rota do DOXP (plantas) Biossíntese do ABA Via direta Rota do mevalonato (fungos) Giberelinas DMAPP= dimetilalil pirofosfato IPP= isopentenil pirofosfato FPP= farnesil pirofosfato GPP= geranil pirofosfato GGPP= geranilgeranil pirofosfato ABA ABA

7. Etapas finais da síntese do ABA C40 Citossol NCED C15 SDR = desidrogenase/ redutase de cadeias curtas NCED = 9-cis-epoxi-carotenóide dioxigenase Xantoxal SDR AO AO= aldeído oxidase

8. Mutantes deficientes em ABA • Auxiliaram na elucidação da via de síntese. • Apresentam: • Fenótipo murcho e/ou • Viviparidade de sementes. • Aplicação de ABA exógeno restaura fechamento estomático.

9. Desacelerado em caso de stress hídrico Catabolismo Conjugação c/ monossac. ABA-β-D-glicose éster

10. Nova via de catabolismo Não enzimático ? O neoPA foi detectado principalmente em sementes e plântulas. Ainda não se sabe o destino posterior do neoPA. Zhou et al. (2004)

11. Nova via de catabolismo (2) (Zhou et al. 2004) RNAm 9´OH ABA tem efeito sobre indução dessa enzima O efeito do neoPA é fraco

12. Regulação do metabolismo (+)-ABA-G Formas inativas Taxa de Biossíntese ZEP NCED ABA-G apoplasto -glicosidase (+)-ABA

13. Transporte de ABA Sauter et al. (2002) Biossíntese no mesofilo Sequestro e catabolismo no simplasto do mesofilo Carregamento do floema via simplasto e apoplasto Alcalinização da seiva bruta sob stress hídrico Seiva bruta • ABA livre • ABA conjugado Seiva elaborada • ABA livre • ABA conjugado Carregamento do xilema Síntese no simplasto da raiz Movimentação via simplasto e apoplasto Produção de formas conjugadas

14. ABA livre x conjugado O ABA conjugado é uma forma importante de transporte a longa distância (Sauter et al. 2002).

15. Transdução de sinal • A transdução de sinal depende da existência de um receptor. • Identidade do receptor do ABA? • Talvez seja um canal de cálcio, • Talvez ative uma GTPase. • Localização do receptor? • Plasmalema ou citossol? • Núcleo celular? • Há um receptor ou vários? • Existem diferenças de respostas aos enantiômeros. • A busca pelo receptor do ABA não tem tido sucesso, mesmo com as técnicas de engenharia genética (Finkelstein et al. 2002).

16. Evidências da localização intracelular do receptor Não descarta a possibilidade do ABA ligar-se a um receptor na plasmalema “pelo lado de dentro”. Microinjeção UV ABA “encaixotado” (Allan et al. 1994; Schwartz et al. 1994)

17. Evidências da localização do receptor na plasmalema • O ABA é incapaz de atravessar a plasmalema em pH 8, mas ainda ocorre fechamento estomático parcial (Anderson et al. 1994), portanto o ABA teria de agir “pelo lado de fora”. • Ligação do anticorpo JIM19 a glicoproteínas na membrana plasmática é inibida competitivamente pelo ABA (Desikan et al. 1999). • Acúmulo de ABA no apoplasto das células guarda resulta em fechamento estomático (Zhang e Outlow 2001).

18. Finalmente localizado o receptor do ABA? • bio-ABA e novas técnicas: • citometria de fluxo (FCM); • microscopia laser confocal (CLSM). Composto fluorescente Yamazaki et al. (2003)

19. Fluorescência com bio-ABA • Protoplastos isolados de células guarda; • O bio-ABA ligou-se à plasmalema; • O receptor forma “clusters”; • 103 a 104 receptores por protoplasto. Yamazaki et al. (2003)

20. O bio-ABA tem ação fisiológica. O bio-ABA foi reconhecido pelo provável receptor e ocorreu transdução de sinal. Yamazaki et al. (2003)

21. Inibição competitiva pelo ABA Provável receptor reconhece o ABA . Yamazaki et al. (2003)

22. Natureza química do receptor? • Proteinase K causou redução da ligação do bio-ABA. • Inibidor da proteinase ou uso de proteinase denaturada resultaram em aumento da ligação do bio-ABA Yamazaki et al. (2003)

23. Seqüência de aminoácidos do provável receptor do ABA (Razem et al. 2004) Essa proteína recebeu o nome de ABAP1 Tem um domínio WW similar à proteína de controle da floração (FCA) em Arabidopsis.

24. A proteína ABAP1 Foi obtida da fração microssomal da camada de aleurona de cevada. É uma proteína de membrana? Embora seja rica em aminoácidos hidrofílicos. 52 kDa (Razem et al. 2004) X 42 kDa da epiderme de folhas de “broad bean” (Zhang et al. 2002). Seriam receptores diferentes nas duas espécies ? ABAP1 não se expressa em folhas de cevada. Múltiplos receptores na mesma planta? 3H-(+)-ABA. Razem et al. (2004)

25. A proteína ABAP1 Liga-se ao isômero natural do ABA de acordo com o pH. Razem et al. (2004)

26. Um modelo para o receptor do ABA Talvez seja um canal de cálcio

27. Mensageiros secundários • ADP ribose cíclico (cADPR) (Schroeder et al. 2001). • O fosfolipídio esfingosina-1-P (SIP) • O inositol tri-fosfato está envolvido com a ativação de canais de íons. • H2O2 e o óxido nítrico estão envolvidos na sinalização do ABA (Desikan et al. 2003). • O nível de Ca2+ no citossol afeta a abertura estomática.

28. Mensageiros secundários envolvidos no fechamento estomático induzido pelo ABA cADPR = ADP ribose cíclico PLC = fosfolipase C InsP3 = inositol trifosfato Ca2+ exerce feedback positivo SV = canais de liberação de lenta de Ca2+ vacuolar Schroeder et al. (2001)

29. Um gerador de mensageiro secundário? • NADPH oxidase • Uma proteína de membrana com Ca2+ “binding motifs”; • Ativada por G proteínas (GTPases); • Codificada pelo gene rbohA (respiratory burst oxidase homolog A); NADPH + O2  NADP++O2-+ H+ O2-  H2O2 Stress oxidativo • Talvez relacionada com a resistência a patógenos. • 105 a 108 kDa; Keller et al. (1998)

30. G proteínas na transdução de sinal Uma GTPase (AtRac1) que se expressa preferencialmente em células-guarda. Essa enzima é inibida pelo ABA. Adição de ABA Lemichez et al (2001)

31. Transdução de sinal em cascata Membrana • As MAP quinases estão envolvidas na transdução de sinal em várias vias hormonais. • São também ativadas por fosforilação (MAPKK) Adaptado de Morris (2001)

32. Respostas induzidas pelo ABA • Rápidas • Movimentos estomáticos • Lentas • Expressão gênica: • Indução do acúmulo de reservas em sementes; • Indução de dormência; • Indução da tolerância à dessecação; • Inibição da expressão de enzimas hidrolíticas; • Aumento da tolerância ao stress (hardening).

33. Respostas rápidas: Canais de íons envolvidos nos movimentos estomáticos Inibição da abertura Indução do fechamento Indução do Fechamento Canais de Ca2+ Canais de ânions (S e R) Canais de K+ out Canais no tonoplasto (VK e FV) Inibição da abertura Bomba de H+ Canais de K+ in Schroeder et al. (2001)

34. O ABA e o citoesqueleto O ABA induz a desorganização dos filamentos de actina nas células guarda. O processo é mediado pelo cálcio citoplasmático, por quinases e fosfatases. Resultando em fechamento estomático. Hwang & Lee (2001)

35. Actina no fechamento estomático Combinou-se proteínas fluorescentes com a actina e a tubulina. A adição de ABA resulta em desorganização dos filamentos de actina e os estômatos fecham-se. • Os mutantes abi1 não apresentam alteração do citoesqueleto em resposta ao ABA. • A GTPase (AtRac1) está envolvida nessa resposta. Lemichez et al. (2001)

36. Respostas lentas Genes ABA - responsivos • Promotor dos genes • ABRC = “ABA responsive complex” • ABRE = “ABA responsive element” • CE = “coupling element” Seqüência consenso Estas seqüências estão localizadas upstream em relação às seqüências codificadoras; São reconhecidas por fatores de transcrição. Seqüência consenso

37. Realizadas para compreender a seqüência de nucleotídeos necessária para o reconhecimento pelos fatores de transcrição responsivos ao ABA Mutações dirigidas • Descobriu-se dois segmentos na região do promotor dos genes que são importantes para esse reconhecimento: • ABRE e • CE. Shen & Ho (1995)

38. Promoter Gene reporter Super- expressão em resposta ao ABA. Foram inseridas várias cópias da seqüência ABRE na região do promotor dos genes Quanto mais cópias maior a expressão Shen & Ho (1995)

39. G-box • Ocorre em diversas regiões promotoras de genes responsivos a fatores ambientais (Shen & Ho 1995); • Seqüência- consenso: ACGT. Os elementos ACGT isolados não conferem responsividade direta ao ABA. A determinação da resposta depende da seqüência de nucleotídeos ao redor do ACGT que provavelmente interage com os fatores de transcrição (Velasco et al. 1998).

40. Tabela gbox e CE Shen & Ho (1995)

41. ABRC x GARC Box 2 W-box Shen et al. (2001)

42. Fatores de transcrição (TF) São “trans-acting proteins”; Ligam-se a regiões específicas do DNA; Reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos; Podem ser ativados por fosforilação (MAP quinases). Vários TFs podem ser necessários antes do acoplamento da RNA polimerase (pol II). Vários tipos de TFs já foram identificados em plantas. Buchanan et al. (2001)

43. Leucine zipper • São fatores de transcrição formados por duas subunidades protéicas. • O aminoácido leucina está presente numa seqüência repetitiva e promove a interação entre as subunidades. • Contém uma seqüência de aminoácidos básicos que interage com o DNA. • Podem formar-se heterodímeros e homodímeros com especificidade diferente. • Reconhecem as G-boxes responsivas ao ABA. Exemplo: VP1

44. Arroz submetido a stress hídrico Buchanan et al. (2001) ABA e stress • O déficit hídrico aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (NADPH oxidase). • A super-expressão de alguns genes aumenta a resistência à seca e à salinidade. • As LEA-proteínas conferem tolerância a dessecação em sementes, são induzidas pelo ABA e também podem ser expressas em tecidos vegetativos. Arroz não-transformado Linhagens com expressão constitutiva do gene HVA1

45. Engenharia genética • Aumentar a sensibilidade ao ABA com deleção do gene ERA1 , que exerce regulação negativa na sinalização do ABA (farnesil transferase). • Reduzir o catabolismo do ABA para aumentar a tolerância à seca. • Como? Schoereder et al. (2001)

46. Respostas independentes do ABA Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki (2000)

47. “Genes de stress” não-responsivos ao ABA Fator de transcrição Buchanan et al. (2001)

48. Interação com outros sinalizadores ABA x Etileno Ação antagônica Beaudoin et al. (2000)

49. Modelo para células de aleurona ABA x GA ABI 1 (Proteína fosfatase 2C) (LEA proteínas) VP1 Ação antagônica (Fator de transcrição) (Proteína quinase) Adaptado de Zentela et al. (2002)

50. ABA x Citocininas • As citocininas reduzem a sensibilidade das células-guarda ao ABA (Radin et al. 1982). • Efeito antagônico do ABA e citocininas na senescência foliar: • O ABA acelera, • As citocininas retardam.