Metody badań strukturalnych w biotechnologii

1. Metody badań strukturalnych w biotechnologii Wykład II Spektrometria masowa

2. Spektrometria masowa (MS – Mass Spectrometry) to dynamicznie rozwijająca się metoda analizy instrumentalnej związków organicznych. Badany związek doprowadza się do jonizacji i rozpadu na naładowane fragmenty, które przyspiesza się polem elektrycznym. Uzyskany strumień jonów rozdziela się wg stosunku ich masy do ładunku i mierzy natężenie prądu jonowego odpowiadające poszczególnym jonom.

3. Zastosowanie spektrometrii masowej: • określanie masy atomowej związku chemicznego, • badania strukturalne izomerów, • badania strukturalne biopolimerów i związków pochodzenia naturalnego

4. Sprzężenie z chromatografią

5. Schemat ideowy

6. Metody jonizacji próbki: -jonizacja strumieniem elektronów (EI), -jonizacja chemiczna (CI), - jonizacja polem (FI), • bombardowanie szybkimi atomami (FAB) • ESI (Elecrtospray Ionization) • MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization)

7. Jonizacja strumieniem elektronów (EI – Electron Ionization) Konieczne jest przeprowadzenie badanej substancji w stan pary (poważna wada metody). W wyniku przejścia strumienia elektronów o energii 10-70eV przez pary substancji i wybiciu elektronu z molekuły powstaje kation rodnikowy

8. Jonizacja chemiczna (CI – Chemical Ionization) Podobnie jak w przypadku EI konieczność przeprowadzenia związku w stan pary ogranicza mozliwość analizy takich substancji jak peptydy, cukry, białka. W metodzie tej wykorzystuje się tzw. jony pierwotne powstałe na skutek bombardowania elektronami gazu reagującego (np metan, izobutan, amoniak, woda). Jony pierwotne reagują następnie z cząsteczkami analizowanej substancji.

9. Jonizacja strumieniem elektronów a jonizacja chemiczna

10. Jonizacja polem (FI – Field Ionization) Związek jest odparowywany w pobliżu dodatnio naładowanej elektrody co prowadzi do powstania kationu rodnikowego. Pierwsza metoda umożliwiająca analize peptydów i cukrów, jej wadą jest mała intensywność sygnałów.

11. Bombardowanie szybkimi atomami (FAB – Fast Atom Bombardment) Próbka jest bombardowana strumieniem atomów argonu w wyniku czego uzyskuje się zarówno jony naładowane dodatnio jak i ujemnie. Badany związek jest rozpuszczany w ciekłej matrycy (gliceryna, glikole polietylenowe, etery koronowe). Najlepsza metoda badania makromolekuł pochodzenia naturalnego.

12. Wady metody: • średnia czułość metody, • problemy z analizą mieszanin, • wraz ze zużyciem matrycy możliwość coraz • większego jej wpływu na jakość widma. • Zalety metody: • szybkość i łatwość wykonania, • łatwe do interpretacji widma, • możliwość prostego regenerowania • źródła atomów/jonów.

13. MALDI Próbka umieszczona w matrycy jest zdyspergowana na powierzchni, a następnie ulega desorpcji i jonizacji na skutek działania laserem. Metoda ta jest stosowana głównie do sekwencjonowania peptydów i określania masy cząsteczkowej białek.

14. C O O H C O O H C O O H O H H C O 3 N H O H O O C H 3 C O O H H O O C C N H O N N H O O H N H 2 N C O O H N C O O H Przykładowe matryce CHCA DHBA

15. Zalety metody: • możliwość badania układów o masie dochodzacej do • 300000Da, • wysoka czułość, • delikatna jonizacja, umożliwiająca małą fragmentację, • tolerancja dla soli w stężeniu milimolowym, • możliwość nadania mieszanin • Wady metody: • Stosowanie matryc może stanowić problem w pomiarach • dla związków o masie poniżej 700Da, • Możliwość fotodegradacji na skutek desorpcji/jonizacji • laserem, • stosowanie kwaśnych matryc może powodować rozpad • Niektórych badanych substancji

16. ESI Technika stosowana do badania rozpuszczalnych w wodzie biomolekuł: peptydów, białek, cukrów. Spektrometr masowy jest najczęściej sprzężony z LC. Próbka jest rozpylana i jonizowana za pomocą przyłożonego napięcia, rzędu kilku kV.

17. Zalety metody: • uniwersalna metoda, umożliwiająca przeprowadzenie • substancji z roztworu w formę zjonizowanego gazu, • możliwość badania substancji rozpuszczonych w różnych • rozpuszczalnikach, • wysoka czułość, • kompatybilność ze wszystkimi analizatorami, • Wady metody: • obecność soli i mieszanin może obniżać czułość, • wymagana duża czystość próbki

18. Analizatory stosowane w spektrometrach masowych • analizatory magnetyczne, • analizatory kwadrupolowe, • analizatory mierzące czas przelotu jonów, • analizatory cyklotronowego rezonansu jonowego. Najistotniejsze cechy analizatora to: • rozdzielczość, • zakres mas cząsteczkowych w których można wykonywać pomiar, • czułość

19. Analizator magnetyczny

20. Analizator kwadrupolowy

21. m1 m2 m4 m3 m2 m1 m4 m3 mass scanning mode m1 m2 m2 m2 m2 m2 m4 m3 single mass transmission mode

22. Pułapka jonowa

23. Analizator TOF (Time of Flight)

24. Interpretacja widma masowego Pik główny (podstawowy) – pik o największej intensywności określanej jako 100% Pik jonu molekularnego (macierzysty) M+ - odpowiada strukturze kationorodnika czyli masie badanego związku Piki izotopowe – towarzyszą jonom molekularnym, powstają w wyniku różnego składu izotopowego związku

25. W przypadku małych układów MS jest doskonalą metodą ich rozróżniania – można dokonać pomiaru masy z dokładnością do 0.0001u C5H12 C4H8O M = 72.0939 M = 72.0575 Dla większych cząsteczek nie jest to już takie proste

26. Fragmentacje

27. Fragmentacje

28. Podstawowe reguły procesu fragmentacji: • w czasie fragmentacji łańcucha węglowodorowego faworyzowane jest rozrywanie wiązań C-C, • najłatwiej następuje rozrywanie wiązań C-C w miejscach rozgałęzienia łańcucha, • łatwo rozerwaniu ulegają wiązania C-C odległe o dwa wiązania od wiązania podwójnego, • w pochodnych węglowodorów elektron jest odrywany zwykle od heteroatomu co sprzyja rozrywaniu sąsiadującego z nim wiązania

29. Fragmentacje

30. W czasie procesu fragmentacji powstają kationy najtrwalsze: [CH3CH2CH3]+ → CH3CH2+ + •CH3 M+ = 44 m/z = 29 niewykrywalny Ale już dla nieco większych molekuł sytuacja komplikuje się

32. Jon molekularny M+ = 98 odpowiada wzorowi sumarycznemu C7H14 Pik podstawowy m/z = 83 co sugeruje utratę rodnika metylowego (15u) Pik podstawowy m/z = 69 co sugeruje utratę rodnika etylowego (29u)

33. Fragmentacje

34. Fragmentacje

35. Fragmentacje

36. 337 nm UV laser Fluid (no salt) + _ Gold tip needle cyano-hydroxy cinnamic acid MALDI ESI Łagodne metody jonizacji

37. BIAŁKO Stosując określoną proteazę, można pociąć białko na określone fragmenty np. w przypadku trypsyny w miejscach, gdzie znajduje się arginina i lizyna.

38. 105.3 89.3 = 402.2 112.1 95.4 95.4 105.3 = 601 89.3 97.1 101.8 112.1 Pocięte fragmenty białka mają określoną masę, która może być zmierzona za pomocą MS Lista tych mas jest używana jako wzorzec i daje możliwość określenia sekwencji białka.

39. Każdy pik odpowiada określonej masie (m/z) powstającego jonu 112.1 234.4 890.5 1296.9 1876.4 1987.5 ……. Lista mas dla pików = fingerprint

40. Budowa tandemowego spektrometru masowego MS/MS Próbka Pierwszy analizator Komora kolizyjna Drugi analizator Rejestrator Fragmentacja jonu macierzystego Wybrany jon m/z

41. Porównanie standardowego i tandemowego układu MS

42. Określanie sekwencji aminokwasowej peptydu N-końcowe jony C-końcowe jony

43. Precursor Ion isolation Electrospray Ionization Isolated Precursor Ion Protein Ions Protein or Protein mixture Dissociation Fragment ions spectrum generation Mass analysis of Protein Fragment Ions Database interrogation or “de novo analysis” Protein ID/Characterization Zastosowanie MS do analizy peptydów i białek