Sviluppo di bevande a base di latte arricchite in peptidi bioattivi

1. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Università degli Studi di Bari Convegno Dairy.it Cremona, 27.10.2006 Sviluppo di bevande a base di latte arricchite in peptidi bioattivi Carlo Giuseppe Rizzello

2. Peptidi bioattivi Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • Composti presenti in molti alimenti, generati in seguito ad idrolisi, in vitro o in vivo, di proteine animali o vegetali, aventi un’attività regolatoria sull’organismo animale, al di là del loro valore nutrizionale (Meisel, 2001).

3. Genesi di peptidi bioattivi 1) Idrolisi gastro-intestinale delle proteine alimentari - enzimi naturalmente presenti nel latte (plasmina) - chimosina del caglio - enzimi di origine microbica Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata - in vivo 2) Nei processi di trasformazione (materia prima  prodotto finale) • enzimi gastro-intestinali (tripsina, chimotripsina, pepsina…) • enzimi di origine batterica, fungina e vegetale • metodi fisici (trattamento al calore; alte pressioni) • sintesi chimica - in vitro, con l’impiego di

4. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Proteine del latte: fonte di PB • caseine e siero-proteine contengono peptidi biologicamente attivi “criptati” all’interno della sequenza-precursore e che possono essere rilasciati (digestione o processi di trasformazione della materia prima). • Enzimi coinvolti • proteasi endogene della matrice alimentare • proteinasi e peptidasi dei microrganismi • enzimi proteolitici gastro-intestinali

5. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Quanti mg di peptidi bioattivi possono essere rilasciati dalla proteina-precursore durante i processi di trasformazione alimentare? Da 1 g di caseina potenzialmente si originano 10 – 60 mg di PB (Meisel, 1998)

6. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Principali bioattivita’ evidenziate per peptidi isolati da proteine del latte • Opioide (agonista ed antagonista) • Citomodulatoria • Anti-trombotica • Anti-ipertensiva • Immuno-stimolante • Antimicrobica • Mineral carrier

7. Peptidi “opioidi” Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata agonisti (es.: casomorfine e lattorfine) antagonisti (es.: casoxine) Legame con recettori cellulari (μ, δ e κ) • effetti analgesici • stimolazione secrezione insulina e somatostatina • prolungamento del tempo di transito gastro-intestinale • comportamento • blocco della risposta cellulare ad una sostanza opioido-agonista

8. Peptidi “opioidi” Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • Caratteristiche strutturali:nella maggior parte dei casi similarità con endorfine (sostanze regolatrici endogene), per la presenza di tyr (Y) all’estremità N-terminale e di tyr o phe (F) in 3° o 4° posizione • Applicazioni:alimentazione del bestiame per aumentarne l’efficienza produttiva (grazie all’influenza positiva sull’assorbimento dei nutritivi)

9. Peptidi citomodulatori Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • Influenza sul metabolismo cellulare, in particolare sulla divisione Cellula in presenza del peptide • inibizione proliferazione • induzione della apoptosi • promozione della divisione cellulare • β-casomorfina 7 e CPP β-CN (1-25) inibizione proliferazione cellule leucemiche • (Meisel e Guenther, 1998); • caseine + batteri lattici dello yogurt influenza su cellule Caco-2 • (Mac Donald et al., 1994); • LF bovina (79-93) e β-CN (177-183) stimolano la sintesi del DNA (cellule di ratto) • (Hagiwara et al., 1995; Nagaune et al., 1989).

10. Peptidi antitrombotici trombina I- fibrinogeno fibrina (coagulo insolubile) Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Coagulazione sangue II-agglomerazione ed adesione delle piastrine alle maglie di fibrina • Interazione tra le sequenze 400-411 (catena γ del fibrinogeno) e 572-575 ed i recettori piastrinici • stati patologici: formazione di “trombi” (= coaguli) frequente nell’arteriosclerosi  necessità di farmaci anticoagulanti • affinità strutturale e funzionale tra fibrinogeno (400-411) e la CASOPLATELINA (κ-CN f 106-116)(Fiat et al., 1993) • casoplatelina  recettore piastrinico  inibizione dell’aggregazione piastrinica(Jollès et al., 1986; Mazoyer et al., 1992) • altri peptidi: κ-CN ovina (112-116) (Qian et al., 1995b) e LF ovina (39-42) (Qian et al., 1995a)

11. Peptidi immunostimolanti Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • β-casochinina 10 (f 193-209 della β-CN) e β-casomorfina 7 a basse concentrazioni  soppressione della proliferazione linfocitaria; ad alte concentrazioni  incremento della proliferazione linfocitaria (Kayser e Meisel, 1996) • αS1-CN (194-199), β-CN (63-68), β-CN (191-193) fagocitosi + effetto protettivo contro Klebsiella pneumoniae (Migliore-Samour et al., 1989) • CPP stimolano la produzione di IgG da parte delle cellule della milza di ratto(Hata et al., 1998 e 1999) • Lattoferricina f(17-41)(Shinoda et al., 1996) Attivazione leucociti neutrofili (rilascio interleuchina-8)

12. Peptidi con capacita’ legante gli ioni (“mineral carrier”) Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • IDROLISI αS1-, αS2- e β-CN  sequenze contenenti fosfoserina: caseinofosfopeptidi (CPP) • Interazione tra gruppo fosforico (carica negativa) ed i cationi • Trattamenti termici  defosforilazione serina  minore probabilità formazione di CPP

13. Peptidi con capacita’ legante gli ioni (“mineral carrier”) Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • Grado di fosforilazione e capacità di legare ioni: relazione diretta • αS2 >αS1 >β > κ • Nella maggior parte dei CPP cluster di fosfoserina • Ser-ser-ser-glu-glu • Possibili applicazioni(Fitzgerald, 1998) • - stati di carenza nutrizionale (Fe2+, Zn2+ e Mg2+) • - rachitismo (aumento biodisponibilità Ca2+) • - prevenzione della demineralizzazione smalto dentale

14. Peptidi con capacita’ legante gli ioni (“mineral carrier”) Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • αS1 (66-74)3P dall’intestino di suini nutriti con derivati lattiero-caseari (Meisel e Frister, 1988) • β-CN (7-18)3P e β-CN (29-41)1P dall’intestino umano(Chabance et al., 1998) • idrolisi in vitro di Na-caseinato con enzimi di varia natura (McDonagh e Fitzgerald, 1998) • Peptidi mineral carriernon fosforilati da alcune siero-proteine (β-LG, α-LA e LF) (Vegarud et al., 2000)

15. Peptidi antimicrobici Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • Importante componente dei sistemi innati di difesa • inattivazione patogeni • modulazione risposte infiammatorie • Modalità d’azione: • generalmente alterano la permeabilità della membrana cellulare

16. Peptidi antimicrobici - caratteristiche biochimiche - Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • Ai fini dell’attività, importanti: • - carattere cationico (per prima interazione con strato fosfolipidico carico negativamente); • - anfipaticità (canali transmembrana attraverso cui transitano gli ioni) • Classificazione: anfipatici ad α-elica • anfipatici a β-lamine • con ponti disolfuro • ricchi in prolina • anionici

17. Peptidi antimicrobici derivati da proteine del latte: Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • largo spettro d’azione • vantaggi rispetto agli antibiotici • lattoferricine (lattoferrina bovina, umana, murina, caprina) • casocidina f(150-188) as2-CN (Zucht et al., 1995) • isracidina f(1-23) as1-CN (Hill et al., 1974; Lahov e Regelson, 1996) • f(184-210) -CN umana (Minervini et al., 2003) • kappacina f(106-169) -CN (Malkoski et al., 2001) • f(63-117) -casein

18. Il ruolo dell’ACE nei sistemi della renina-angiotensina, della callicreina-chinina e nel sistema immunitario.Adattata da Philanto-Leppälä et al., 2001 SISTEMA IMMUNITARIO SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA SISTEMA CALLICREINA-CHININA Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu Immunomodulante chemiotassi Bradichininogeno Angiotensinogeno callicreina Renina Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu migrazione linfocitaria stimolazione macrofagi Bradichinina Angiotensina I ACE (Angiotensin I-converting enzyme) Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe + His-Leu Arg-Pro-Pro-Gly-Phe+Ser-Pro+Phe-Arg Angiotensina II Frammenti inattivi vasocostrizione vasodilatazione Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata

19. Peptidi anti-ipertensivi Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Inibizione dell’ACE → abbassamento dei livelli della pressione arteriosa • correlazione struttura-attività: affinità dell’ACE nei confronti di substrati ed inibitori competitivi aventi a.a. idrofobici (es.: pro, ile, val) nelle 3 posizioni contigue all’estremità carbossilica; tuttavia sono note anche sequenze strutturalmente differenti (Meisel, 1997) • Resistenza ad ulteriore idrolisi e basso P.M.: requisito per l’attività in vivo

20. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Peptidi ACE-inibitori nei formaggi • starter e tempo di maturazione(indice di ACE-inibizione del Gouda a media maturazione > di quello a lunga maturazione)(Gobbetti et al., 2002) • Peptide derivato dall’ s1-CN isolato da Parmigiano stagionato di 6 mesi, ma non dopo 15 mesi di maturazione(Addeo et al. 1992). • Peptidi a basso P.M. (es.: -CN f58-72) identificati in diversi formaggi(Meisel et al. 1997), compresi alcuni formaggi con tempo di maturazione breve (Crescenza e Italico) e medio (Gorgonzola)(Smacchi and Gobbetti 1998; Stepaniak et al. 1995). indice di ACE inibizione (%) Rapporto aminoacidi liberi/aminoacidi nei peptidi [mol/mol]

21. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata A differenza dei peptidi bioattivi endogeni, molti peptidi derivati da proteine del latte presentano proprietà multi-funzionaliDeterminate regioni della struttura primaria delle caseine contengono sequenze peptidiche sovrapposte che esercitano diversi effetti biologiciTali regioni, considerate “strategiche”, sono parzialmente protette da un’ulteriore degradazione proteolitica(Fiat et al. 1993).

22. Peptidi multifunzionali da proteine del latte (esempi)

23. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Sebbene la liberazione di peptidi bioattivi da proteine alimentari sia stata studiata a fondo negli ultimi decenni, soltanto pochi studi hanno considerato le potenzialità dei batteri lattici in tal senso.

24. I risultati sono controversi e non è possibile generalizzare, poiché occorre considerare vari fattori: Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata I batteri lattici, o enzimi da essi derivati, come mezzo per produrre peptidi bioattivi? • Materia prima • Tecnologia • Tipo di prodotto • Starter impiegato (variabilità inter- ed intra-specifica del corredo enzimatico)

25. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Produzione di peptidi bioattivi da idrolizzati di Na-caseinato mediante proteinasi di Lactobacillus helveticus PR4 (Minervini et al., 2003) • COMPARARE le potenzialità di latte di specie diverse nel generare peptidi ad attività antipertensiva • PRODURRE idrolizzati di Na-caseinato arricchiti in peptidi bioattivi multifunzionali verificando la possibilità di utilizzare enzimi derivati da un microorganismo largamente utilizzato nella biotecnologia lattiero-casearia (Lactobacillus helveticus) • Produzione di Na-caseinato a partire da latte di 6 specie (bovino, suino, caprino, ovino, bufalino ed umano) • Idrolisi del Na-caseinato con una proteinasi parzialmente purificata da Lb. helveticus PR4 • Analisi RP-FPLC degli idrolizzati • Identificazione dei peptidi contenuti nelle frazioni attive tramite MS e degradazione di Edman Fasi del lavoro:

26. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Cromatogrammi RP-FPLC degli idrolizzati di Na-caseinato SUINO BOVINO OVINO BUFALINO CAPRINO UMANO

27. Sequenze, e corrispondenti frammenti di caseina, dei peptidi identificati nelle frazioni degli idrolizzati di Na-caseinato prodotti con la proteinasi parzialmente purificata di Lb. helveticus PR4. aSingle-letter amino acid code is used. bMonoisotopic masses are reported. cThe only peptide which had antibacterial activity. All the other peptides were ACE inhibitors.

28. Attività ACE-inibitorie delle frazioni peptidiche grezze (non purificate) e dei peptidi sintetizzati

29. Attività antibatterica del frammento -CN f184-210 identificato nella frazione 19 dell’idrolizzato di Na-caseinato umano Inibizione di Staphylococcus aureus (A), Escherichia coli K12 (B) e Bacillus megaterium (C) da parte della frazione 19 dell’idrolizzato di Na-caseinato umano QELLLNPTHQYPVTQPLAPVHNPISV aSimboli: ++, zona di inibizione molto ampia (ca. 2.0 cm); +, zona di inibizione ampia (ca. 1.5 cm); , zona di inibizione media; -, nessuna zona di inibizione.

30. Conclusioni Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • Serino-proteinasi di Lb. helveticus PR4 utilizzabile per la genesi di PB • Le similarità o le differenze tra i PB sono dovute al grado di omologia ed alla conformazione nativa delle caseine da cui essi originano • Gli idrolizzati di Na-CN possono essere proposti come alimenti funzionali con potenziale azione ipotensiva • β-CN umana come precursore di un peptide antibatterico ad ampio spettro d’azione

31. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Isolamento di peptidi antimicrobici da diverse varieta’ di formaggi italiani(Rizzello et al., 2005) Scopo del lavoro: purificazione, identificazione e caratterizzazione di peptidi antimicrobici isolati da diverse varietà di formaggi italiani, differenti per tempo di maturazione, tipo di latte, caglio e starter microbici utilizzati. Fasi del lavoro: • Analisi RP-FPLC degli estratti acquosi dei formaggi • Saggio delle frazioni per l’inibizione di un microrganismo indicatore • Purificazione (RP-FPLC) delle frazioni attive • Saggio e caratterizzazione dello spettro d’azione delle frazioni attive • Identificazione dei peptidi (MS) contenuti nelle frazioni dotate di attività antimicrobica

32. Formaggio di Fossa mAU Canestrato Mozzarella di bufala mAU mAU 3000 3000 3000 2500 2500 2500 2000 2000 2000 1500 1500 1500 1000 1000 1000 500 500 500 0 0 0 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 min min 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 min Caprino del Piemonte Pecorino Romano mAU Caciocavallo mAU mAU 3000 3000 3000 2500 2500 2500 2000 2000 2000 1500 1500 1500 1000 1000 1000 500 500 500 0 0 0 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 min 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 min 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 min Crescenza Parmigiano Reggiano Gorgonzola mAU mAU mAU 3000 3000 3000 2500 2500 2500 2000 2000 2000 1500 1500 1500 1000 1000 1000 500 500 500 0 0 0 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 min 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 min 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 min Analisi RP-FPLC e separazione in frazioni degli estratti acquosi

33. Attività inibitoria delle frazioni ottenute mediante RP-FPLC dagli estratti acquosi dei formaggi. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata

34. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Spettro d’azione delle frazioni 2, 3 e 4 ottenute per frazionamento RP-FPLC da estratto acquoso di Mozzarella di bufala

35. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Sequenze peptidiche identificate nelle frazioni dell’estratto acquoso prodotto da formaggio Crescenza

36. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Isracidina f(1-23) as1-CN RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRF Kappacina f(106-169) -CN MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTTEAVES TVATLEDSPEVIESPPEINTVQVTSTAV

37. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Conclusioni • Latti didiverse speciecostituiscono potenziali matrici per la produzione di alimenti funzionali contenenti peptidiantipertensivi • Presenza e distribuzionedei peptidi antimicrobici nei diversi formaggi • Analogie strutturalicon peptidi bioattivi riportati in letteratura • Probabile ruolo nel mantenimento di determinatecondizioni igienico-sanitarienel prodotto finito • Compatibilità tra dosi di prodotti lattiero-caseari comunemente assunte eapporti significativi di peptidi antimicrobici

38. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Peptidi bioattivi in alimenti funzionali • Allo stato attuale, i CPP ed i peptidi ipotensivi sono tra gli altri, quelli che sono stati maggiormente proposti come ingredienti di alimenti ideati per fornire benefici specifici • L’odierna conoscenza dei peptidi bioattivi incoraggia la messa a punto di alimenti funzionali contenenti PB prodotti con l’impiego di microrganismi “GRAS” (Generally recognized as safe) • L’isolamento di peptidi bioattivi da idrolizzati proteici è una strategia caratterizzata da rese basse e costi elevati

39. Prodotti lattiero-caseari con proprietà funzionali: formaggio “Festivo”(Ryhanen et al., 2001) Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • - prodotto su scala industriale • - basso contenuto in grassi (11%) • stagionato 13 settimane; • e contenente: • peptidi bioattivi (attività antipertensiva) • CLA (0,45%) attività anticarcinogenica e antiarteriosclerosi • microrganismi probiotici (Lb. acidophilus e Bifidobacteria) • aggiunti allo starter commerciale dopo la pastorizzazione del latte • calcio

40. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Uso di DNA ricombinante per la sintesi di peptidi ACE-inibitori Coppia di oligonucleotidi (nor e rev) codificanti per BP1, BP2 e BP3 Amplificazione primer e clonaggio nel vettore di trascrizione pGEM-T BP1 (β-CN f.57-66) : FAQTQSLVYPFPGPIPNSLP BP2 (β-CNf.73-82): NSLPQ NIPPLTQTPV VVPPF BP3(β-CNf.47-52): EDELQDKIHPF AQTQS Trasformazione delle cellule di Escherichia coli tramite vettore pGEX Liberazione della proteina di fusione dalle cellule ricombinanti pGEX Purificazione della proteina di fusione (cromatografia di affinità)

41. BP2 BP3 BP1 NH2 COOH BP2 BP3 BP1 Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Uso di DNA ricombinante per la sintesi di peptidi ACE-inibitori Rilascio di BP1, BP2 e BP3 per azione di una proteinasi di Lactobacillus helveticus Raccolta di frazioni cromatografiche contenenti BP1, BP2, BP3 Applicazione: BP1, BP2 e BP3 in unlatte fermentato

42. Preparazione di bevande lattiche addizionate di peptidi bioattivi • A) Aggiunta dei singoli peptidi a skim milk (UM = latte non fermentato) • B) Aggiunta dei singoli peptidi a skim milk, inoculo con Lb. acidophilus e fermentazione (FM = latte fermentato) Saggio di ACE-inibizione sulla frazione pH 4.6 solubile di ciascun campione

43. Latti fermentati contenenti peptidi ACE-inibitori Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata CALPIS sour milk • Latte scremato fermentato (37°C, 22 h) con Lactobacillus helveticus e Saccharomyces cerevisiae • Diffuso in Giappone da diversi decenni • 1995: ricerche sul contenuto in peptidi del Calpis

44. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata CALPIS sour milk • IPP e VPP da caseina (Lb. helveticus) (Nakamura et al., 1995) • attività ACE-inibitoria in vitro (IC50< 10 M) • attività anti-ipertensiva su ratti • 100 ml Calpis (0,025 – 0,033 mg peptide/kg di peso corporeo) per 8 settimane su pazienti ipertesi (con controllo placebo); • ETICHETTA “FOSHU”

45. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata EVOLUS fermented milk fermentazione con Lb. helveticus LBK 16 H (37°C, 20 h) • ACE-inibizione: IPP (1,5 mg/100 g) e VPP (2 mg/100 g) • composizione elettrolitica (poco Na+, apporto di Ca2+, K+ e Mg2+) • ETICHETTA “FOSHU”

46. Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata EVOLUS fermented milk- prove cliniche -

47. Sviluppi futuri Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata • Sviluppo di modelli dinamici in vitro con la finalità di studiare l’effetto interattivo di componenti bioattive multifunzionali (Schanbacher et al. 1998). • Messa a punto di un metodo di frazionamento su scala industriale degli idrolizzati proteici. • Studio dell’influenza di diverse tecnologie (in particolar modo, nuove tecnologie, come I trattamenti con alte pressioni) sulla genesi di PB • Studio di peptidi che inibiscono enzimi prolino-specifici. Le prolil endopeptidasi (PEP) possono essere coinvolte nei processi di apprendimento e di memorizzazione ed è stato dimostrato che esse possono generare il peptide “amyloid A4”, alla base del morbo di Alzheimer (Steinmetzer et al. 1993; Saito et al. 1997). • Sviluppo di una grande varietà di alimenti funzionali fermentati