4.2. Genetinės inžinerijos metodai

1. 4.2. Genetinės inžinerijos metodai Išskiriami 4 pagrindiniai genetinės inžinerijos etapai: • DNR izoliavimas. • Geno izoliavimas ir klonavimas. • Geno modifikacija. • Transformacija (geno perkėlimas). 4.2. Genetinės inžinerijos metodai

2. Genas 2 Genas 3 Genas 1 1) DNR izoliavimas Ląstelės branduolyje yra chromosomos, sudarytos iš DNR molekulės, kurioje esantys genai sąlygoja visų organizmui reikalingų baltymų gamybą. Reikia išskirti šią DNR molekulę iš kitų ląstelės organelių. Supaprastintina ląstelė ir DNR molekulė Genai išsidėstę išilgai DNR grandininės (kiekvienas atitinka savitą nukleotidų seką) Izoliuojama visa augalo, turinčio pageidaujamą požymį DNR (visų chromosomų DNR) 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 1) DNR izoliavimas (1)

3. Genas kurį reikia izoliuoti (tikrovėje nėra matomas plika akimi) DNR 1. Augalo audiniai užšaldomi skystu azotu ir sutrinami, taip suardant ląstelių sieneles. 2. Sutrinti audiniai ištirpinami druskingame tirpale ir centrifuguojami: tirpalas sluoksniuojasi ir DNR, RNR ir kitos sunkesnės molekulės nusėda mėgintuvėlio dugne. 3. Įpylus organinio tirpiklio (pvz. fenolis), ištirpsta prie DNR ir RNR prisijungę baltymai; įpylus vandens su pamaišius, tirpalas sluoksniuojasi: tirpiklis su baltymais nusėda, palikdamas DNR ir RNR molekules viršutiniame sluoksnyje. 4. Paveikus tirpalą ribonukleazės enzimu degraduodama RNR, o įpylus alkoholio, DNR molekulės koncentruojasi taip yra išsiskirdamos iš tirpalo. 5. DNR izoliuojama ir laikoma pastovaus PH tirpale 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 1) DNR izoliavimas (2)

4. 2a) Genų izoliavimas Vizualiai išskirti genų neįmanoma. Sudaromos genų bibliotekos= skirtingų DNR dalių (~geno dydžio) patalpintų bakterijose kartotekos. Restriktazės karpančios DNR į geno dydžio dalis 1. Į kolbą įdėtos restriktazės (“kerpantieji” enzimai) “sukarpo” DNR molekules į ~geno dydžio dalis. Dominantis genas “Kerpantieji” enzimai- tai spec. baltymai, kerpantys DNR grandinę tam tikroje nukleotidų sekos vietoje – pvz. C †AATTC 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 2) Genų izoliavimas (1)

5. 3. Tirpalas su DNR atkarpomis įpilamas į tirpalą su bakterijų plazmidėmis (spec.DNR), kurios iš anksto sukarpytos tų pačių enzimų pagalba ir specialiai modifikuotos, įterpiant antibiotikams atsparų geną. + = Restriktazės sukarpyta DNR su dominančiu genu Tos pačios restriktazės sukarpytos plazmidės 4. Kadangi plazmidės DNR ir tiriamos DNR sukarpytos tomis pačiomis restriktazėmis (=tinka DNR atkarpų ir plazmidžių DNR galai), DNR atkarpos įsiterps į plazmidės. Pastaba: genai gali įsiterpti ne į visas plazmides, todėl reikės patikrinimo 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 2) Genų izoliavimas (2)

6. Įpilamos bakterijų ląstelės Bakterijos su nauju genu Antibiotikas Gyvos liko tik bakterijos su nauju genu Elektrošokas sienelės atsidaro 5. Plazmidės su naujais genais įterpiamos atgal į bakterijas elektros šoko būdu (ląstelių sienelės įtrūksta ir plazmidės patenka į vidų). Į dauguma bakterijų įsiterps naujos plazmidės su naujais genais 6. Bakterijos supilamos į antibiotikų tirpalą; kadangi buvo naudotos plazmidės, turinčios atsparų antibiotikams geną, gyvos liks tik naujus genus turinčios bakterijos. 7. Bakterijos dauginasi, susidaro jų kolonijos. Kad kiekvienoje lėkštelėje būtų skirtinga DNR atkarpa, reikėtų keliolikos 1000 lėkštelių. Bakterijos ( kartu su naujais genais) saugomos ir naudojamos kaip knygos bibliotekoje. Tokie bakterijų rinkiniai vadinami genų bibliotekomis. 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 2) Genų izoliavimas (3)

7. Bakterijos dauginasi 2b) Genų klonavimas 7. Reikia rasti kurioje kolonijoje yra norimas genas. Tam naudojamas šį geną žymintis molekulinis žymuo (PCR pradmenys iš abiejų geno pusių ar hibridizacijos markeriai). ? Žymenys: DNR atkarpos kurių kodas sutampa su geno dalimi (nustatomi sankibos grupių analizės bandymais ar genominių duomenų bazių analizės rezultate (cDNR, EST)). 8. Nustačius kurioje kolonijoje yra normas genas, ši kolonija izoliuojama ir dauginama (klonuojama) ir tokiu būdu paruošiama tolesniam etapui pačio geno modifikacijai. DNR išgryninimas Genas izoliuotas ir klonuotas tolesnei modifikacijai 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 2) Genų klonavimas (1)

8. Pradas Koduojanti Koduojanti Promotorius Pabaigos Pabaigos Baltymai b) a) dalis dalis Nusako, kada, Nusako, kada, dalis dalis kur ir kiek kur ir kiek Sąlygoja kodo Sąlygoja kodo Nusako kokį Nusako kokį baltymo gaminti baltymo gaminti baltymą gaminti baltymą gaminti (įjungia/išjungia) (įjungia/išjungia) (=toliau kitas genas) (=toliau kitas genas) Genui pakeičiama koduojanti dalis Baltymas DNR Aminorūgštys Aminorūgštys Aminorūgštys 3) Genų modifikacija Genus galima modifikuoti, pakeičiant jų funkcines dalis taip, kad įterpus, genai sąlygotų pageidaujamą požymio išraišką. Promotorius (liet. prado) dėka pvz. žievės ląstelėse nėra išreikšti žiedams reikalingi baltymai (nors žiedų genai yra visur). Geną sudaro 3 funkcinės dalys: nuskaitymo pabaigą nuskaitymo pabaigą Pav. parodytos 3 skirtingos koduojančios dalys, o pasekoje pasikeičia baltymo amino- rūgščių sudėtis (pažymėta spalvotos figūromis) Trijų nukleotidų raktas (kodonas) koduoja atitinkamą aminorūgštį, kurių rinkinys sudaro baltymą. 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Genų modifikacija (1)

9. Prieš atliekant geno modifikacija reikalingas planavimas: • Kada reikia norimo baltymo? (promotorius). • Kur riekia norimo baltymo? (promotorius). • Kiek norimo baltymo reikia? (promotorius). • Kokio baltymo reikia? (koduojanti dalis). Reikia parinkti tikslinius geno promotoriaus ir koduojančios dalies derinius. Pvz. jei norima modifikuoti organizmą įterpiant tam tikram kenkėjui nuodingą baltymą koduojantį geną, reikia įvertinti: ką ir kada valgo kenkėjai? kiek nuodingo baltymo reikėtų? (jei per > tai be reikalo naudotų išteklius). 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Genų modifikacija (2)

10. Problemos pavyzdys. Pastebėta, kad dirvos bakterijos genas Bt CRYA gamina baltymus nuodingus kenkėjams. Tačiau perkėlus bakterijos geną į augalą, jo pradas netiks ir neįjungs geno = reikia pakeisti pradą. Kenkėjui nuodingas baltymas • Pvz. gali būti naudojami du žinomi genų pradai- 35S, ir PEP: • 35S pradas gautas iš tam tikro viruso ir aktyvuota genus visose ląstelėse (gali įjungti bet kokį geną bet kur), todėl įterptas genas veiks visame organizme visus metus. • PEP pradas gautas iš fotosintezėje dalyvaujančio geno. Jis veiks tik “žaliuose” audiniuose ir tik šiltojo sezono metu. Išreikštas visuose audiniuose Išreikštas žaliuose audiniuose 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Genų modifikacija (3)

11. 1.Restriktazės iškerpa iš plazmidės reikiamą geną. 2. Kitos restriktazės sukarpo geną į funkcines dalis. 3.Įdedamos naujos geno dalys, kurių dalis prisijungia prie likusios modifikuojamo geno dalies. Modifikuotas genas Bakterija 4. Įdedamos naujos su attinkamais enzimais sukarpytos plazmidės, į kurias įsiterpia modifikuotas genas. Plazmidės įterpiamos į bakterijų bibliotekas. 5. Bakterijų kolonijos su modifikuotu genu dauginamas ir saugojimas iki kito etapo – geno perkėlimo 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Genų modifikacija (4)

12. Genų modifikacijos pavydžiai: (1) Įterpiamas kenkėjui nuodingas genas, (2) Roundup’ui atsparus genas = galima purkšti, (3) Padidinti pageidaujamų junginių kiekį (pvz. sojų maistingumą ar vitamino A kiekį ryžių endosperme). (4) Lignino modifikacija medienoje: įterpiamas genas slopinantis liginio sintezę, taip sumažinant celiuliozės išskyrimą apsunkinančio lignino kiekį ląstelėse. Atsparumas roundap’ui Mažiau lignino medienos ląstelėse 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Genų modifikacija (5)

13. 4) Transformacija Transformacija tai naujo geno yra įterpimas į ląsteles, iš kurių išauginamas naujas augalas. 1. Genai įterpiami į funkcijų neįgijusias ląsteles (kaliusą) bakterijų, dalelių bombardavimo ar elektros impulsų pagalba. 2. Audinių kultūros metodai leidžia iš šių ląstelių (audinių) išauginti naują augalą. Genas Įterpimas Augimas Naujas genas visose ląstelėse 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Transformacija (1)

14. Genas Genas N Genas2 Genas 1 • Geno įterpimo sunkumai: • Genas turi patekti būtent į chromosomas. • Po įterpimo ląstelės turi likti gyvos. • Kaip identifikuoti kuriose ląstelėse genas įsiterpė? • Turi būti parinktos specialios ląstelės (kaliusas), kurios gali išaugti į naują augalą, • Naujas genas neturi įsiterpti į esančio geno dalį, bet jį pilnai pakeisti. ? Genas 1 Genas N Genas 3 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Transformacija (2)

15. Bakterijų metodas Kaliuso audiniai laikomi tirpale su bakterijomis, kurios įterpia savo plazmides į kaliuso ląstelių branduoliuose esančias DNR molekules. Privalumai - tai natūralus metodas, bakterija pati įterpia savo plazmidę kartu su nauju genų į įterpimui tinkančia DNR molekulės vietą (bus išvengta problemų kai genas įterpiamas ne į branduolį ar viduryje kito geno, kas sutrikdo jo veiklą) 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Transformacija (3)

16. Kiti įterpimo būdai Tikslas įterpti naują geną su jį identifikuoti leidžiančiu markeriniu genu į ląstelės branduolį jos nepažeidžiant. Įterpimo sėkmę lemia bandymų skaičius, t.y didelis skaičius įterpimo bandymų lemia didesnę sėkmę. Aukso dalelė su geno kopijomis Genų patranka. Mikroskopinės aukso dalelės padengiamos 100-tais geno kopijų išaunamos kaliuso ląsteles. Principas- vaakumo, kameroje dalelės iššaunamos į aukšto slėgio dujomis. Kaliuso ląstelės helis Branduolio terpėje genai pasklinda ir įsiterpia į chromosomas Genų patranka Audinių kultūra- augalo išauginimas Minusas – genas gali įsiterpti bet kur ir kelis kartus vienoje vietoje. 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Transformacija (4)

17. Buvęs tam tikras genas Įsiterpęs naujas genas Įsiterpė kelios geno kopijos Transformacijos kontrolė • Koks genas buvo įterptas? • Kur jis buvo įterptas (kokioje chromosomos dalyje)? • Kiek jo kopijų buvo įterpta? Gali įsiterpti bet kurioje dalyje ir bet kurioje chromosomoje Gali įsiterpti į jau esančio geno vidurį ir taip nutraukti jo veikimą Gali įsiterpti kelios geno kopijos, todėl organizmas pats gali šį geną “išjungti”. Išeitis: išbandyti daug GMO augalų ir atrenkami tik sveiki turintys modifikuotą požymį (pvz. iš 1000 vnt.- 1 vnt.) 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Transformacija (5)

18. 5) GM augalo išauginimas. Audinių kultūra Audinių kultūra tai augalo išauginimas dirbtinėje aplinkoje (in vitro) iš izoliuotų ląstelių grupės (audinio). Ląstelės iš įvairių augalo dalių (pvz. iš gemalo užuomazgos), įdedamos į lėkštę, kur esanti terpė neturi augimo hormonų, “įsakančių” į kokį audinio tipą joms vystytis. Ląstelėms dalinantis, susiformuoja specifinės funkcijos neatliekančių ląstelių masė, vadinama kaliusu. 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)

19. Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo išauginimui reikalingą genetinę informaciją, Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į gemalų ląsteles sąlygojančius augimo hormonus ir paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos rėžimu, išauginamas naujas gemalas + gemalų genezė = daug gemalų išaugančių į augalus Augalo dalys, iš kurių gali būti paimti audiniai mikrodauginimui Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse. 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (2)

20. Somatinė gemalų genezė • Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu yra somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio mikro-dauginimo metodas kai gemalai išauginami iš vegetatyvinių ar negametinių audinių. • Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į gemalų pirmines ląsteles, kurios gali būti užšaldomos skystame azote neribotam laikui. • Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų pirminėms ląstelėms indukuojamas augimas į gemalus, kurie apvelkami dirbtiniu maisto medžiagų sluoksniu ir taip paverčiami į dirbtines sėklas • Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į medelius medelynuose (pigu). P. pušies somatinės gemalų genezės stadija (Miškų institutas, Švedija ) Somatiniai sitkinės eglės gemalai 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (3)

21. Tam, kad atskirti kaliuso ląsteles su nauju genu, naudojami molekuliniai žymenys (ar specialios fluorescencinės molekulės), kurie įterpiami į naujus genus turinčias bakterijų plazmides ir taip patenka į augalo ląsteles kartu su naujuoju genu. Bakterija Chromosoma Žymuo Įterptas genas Žymuo gali būti atsparumą antibiotikams turintis genas, tada kaliuso ląstelės paveikiamos antibiotikais ir atrenkamos tik gyvi audiniai. 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (3)

22. Alternatyvos audinių kultūrai Audinių kultūros problema- tinkamos terpės ir hormonų parinkimas, kurie gali skirtis tarp rūšių ir genotipų. • Alternatyvos • – genų įterpimas į lytinių organų pradines ląsteles, kurios išsivystys į žiedadulkes ar kiaušides. Šių augalų sėkliniai palikuonys turės naujus genus. • genų įterpimas tiesiai į žiedadulkes, • žiedų “mirkymas” skystyje su modifikuotomis bakterijomis (perspektyviausias). 4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (4)