Experimentelle Urologie 2006 Aufnahme und Verteilung von Antisense Wirkstoffen

1. Experimentelle Urologie 2006 Aufnahme und Verteilung von Antisense Wirkstoffen nach intravenöser und intravesikaler Gabe C.E. Blietz1, I. Kausch1, L. Blumhoff1, B. Kynast2, C. Doehn1, D. Jocham1 (1)  Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, Klinik und Poliklinik für Urologie (2) Faustus Forschungs GmbH, Leipzig Abstrakt EinleitungAntisense Oligonukleotide (AS-ON) gegen Ki-67 konnten in vorhergehenden Studien eine hohe antitumorale Wirkung erzielen. Ki-67 Antisense Oligonukleotide wurden in einem Tiermodell intravenös und intravesikal zur genaueren Analyse der Effektivität und Verfügbarkeit appliziert. Insbesondere die Blase erscheint ein ideales Organ für die topische Therapie. Material und MethodenKi-67 AS-ON wurde NMRI Mäusen in 3 Konzentrationen intravenös appliziert. Die Tiere wurden täglich beobachtet, nach 14 Tagen geopfert und nachfolgend autopsiert. Nach Applikation von 3H-markierten AS-ON für 2 Stunden in die Blasen von Ratten wurde die Aufnahme der AS-ON in die Blase histopathologisch und mittels Autoradiographie untersucht. ErgebnisseNach intravenöser AS-ON Gabe wurden bei niedrigerer Konzentration (215 mg/kg KG Körpergewicht) keine Nebenwirkungen beobachtet. Nach Gabe von 464 mg/kg KG wurde eine leicht verminderte Motilität bei allen Tieren beobachtet. Zwei Tiere verstarben nach Gabe von 1000 mg/kg KG. In dieser Gruppe wurde eine leichte bis starke Verminderung der Motilität gesehen. Im Rahmen der Autopsie wurden bei keinem Tier Veränderungen gesehen. Die AS-ON Aufnahmestudien bestätigten die gute lokale Verfügbarkeit.. SchlussfolgerungDie lokale Tumortherapie der Blase zeichnet sich durch eine hohe lokale und geringe systemische Konzentration der antitumoralen Nukleinsäurekonstrukte aus. Geringe Nebenwirkungen und signifikante Down-Regulation der Zielgene in unseren Versuchen unterstützen diese Aussagen. Die Ergebnisse einer Phase I Studie zur intravesikalen Therapie bei Patienten mit Blasentumoren stehen noch aus. Systemische ApplikationMethoden I Ergebnisse I Methoden III und Ergebnisse III NMRI Mäuse Ki-67 AS-ON i.v. 5+ 5 215 mg/kg KG 5+ 5 464 mg/kg KG 5+ 5 1000 mg/kg KG Tägliche klinische Visite. Opferung Tag 14. Sektion. • Tumor Implantation: Narkose von 6 C57/Bl6 Mäusen (Pentobarbital 40mg/kg i.p.), Katheterisierung 24 Gauge Insyte-W Katheter (Becton-Dickinson Heidelberg), intravesikale Koagulation über Draht für 5 sec. Applikation von 1x 105 /100l Medium Tumorzellen MB 49. Katheterblockung für 2 h. • Intravesikale AS-ON Applikation: Tag 30 erneute Narkose und Katheterisierung. Topische Applikation von FITC markierten Ki-67 AS-ON. • Tier 1 – 2 NaCl intravesikal • Tier 3 – 4 Ki67 Antisense 25µg (=1µg/mg KG) • Tier 5 – 6 Ki67 Antisense 50µg (=2µg/mg KG) • Opferung nach 12 h, Sektion unter Asservierung Blase, Nieren. • Auswertung: • Makroskopisch kein Tumortake, FACS Analyse nur geringster Nachweis von Fluoreszenz in Blase • Fluoreszenzmikroskopisch Ki-67 AS-ON Anreicherung in der Blasenwand Topische ApplikationMethoden II • Methodik: Anästhesie von 12 weiblichen Ratten (Sprague Dawley) mit Urethan i.p. (40ml/kg KG), Kathetereinlage und Applikation von 0,1 ml Testsubstanz (5 mg/ml) intravesikal, Ligatur an Harnröhre zur Vermeidung von Urinverlust, Opferung nach 2h. • Auswertung: • Makroskopische Auswertung der Blase • Histopathologische Auswertung der Blase • Asservierung Blase, Blaseninhalt und Kadaver ohne Fell zur 3H-Determination • Mikro-Autoradiographie der Blase durch Inkubation mit photographischer Emulsion A D B C Ergebnisse II Fluoreszenzmikroskopie: FITC markierte Ki-67 AS (Maus 6) Therapie mit Ki-67 AS-ON FITC markiert 2µg/mg, Harnblasengewebe 2 verschiedene Areale (A/B und C/D) (Vergrößerung 63x), Grün= FITC-Fluoreszenz, Rot=Propidiumiodid (DNA) • Keine makroskopischen Auffälligkeiten • Histologisch unspezifisches Ödem • Venendilatation als Reaktion auf AS-ON • 3H-Determination: • 49,9% der Testsubstanz Blaseninhalt • 90,4% Detektion der Testsubstanz • Hohe lokale Verfügbarkeit in Blasenwand • Autoradiographie: • Intrazelluläre Akkumulation im Epithel • Interzelluläre Akkumulation in Muskularis Konzentration Ki-67 AS-ONdurch 3H-Determination Schlussfolgerung • Bei systemischer Applikation von 215 mg/kg KG Ki-67 AS-ON wurden keine Nebenwirkungen gesehen • Die Mortalität bei systemischer Applikation von 1000mg/kg KG Ki-67 AS-ON lag bei 20% • Bei topischer Applikation sind 50,1% Ki-67 AS-ON nach 2 Stunden aufgenommen bei hoher lokaler Verfügbarkeit in der Blasenwand • Immunfloureszenz mit Anreicherung von Ki-67 AS-ON nach 12 h nach lokaler Gabe in Blasenwand • Untersuchungen zur Ki-67 AS-ON Aufnahme in Tumorzellen nach topischer Gabe bleiben abzuwarten Teile der Versuche wurden von Faustus Forschungs GmbH, Leipzig gesponsort