Loeng 6 Ensümaatiline katalüüs I

1. Loeng 6Ensümaatiline katalüüs I Katalüüsi mehhanismid

3. Katalüüs bioloogilistes süsteemides Vaatleme järgmist lihtsat reaktsiooni: 2H2O2 2H2O + O2 • Reaktsiooni kulgemine paremale on termodünaamiliselt soodustatud • Reaktsioon kulgeb aeglaselt kõrge aktivatsioonibarjääri tõttu • Selleks et reaktsioon kulgeks kiiresti võime molekulidele energiat anda (kuumutada) • Bioloogilistes süsteemides ei ole paraku kuumutamine lahenduseks • Bioloogilistes süsteemides on praktiliselt kõik reaktsioonid katalüüsitud efektiivsete bioloogiliste katalüsaatorite ensüümide poolt

4. H-O H-O O-H üleminekuolek O-H Energia aktivatsioonienergia reaktandid DG* 2H2O2 produktid DG 2H2O + O2

5. H-O H-O O-H üleminekuolek O-H Energia aktivatsioonienergia reaktandid DG* 2H2O2 produktid DG 2H2O + O2 Ensüümreaktsiooni aktivatsioonienergia Reageerivaid ühendeid nimetatakse ensüümkatalüüsis tavaliselt substraatideks

6. Ensüümkatalüüs • Ensüümid võimaldavad reaktsioonil kulgeda alternatiivset teed mööda • Ei muutu: reaktandid, produktid ja tasakaal • Muutub: alaneb aktivatsioonibarjäär, suureneb kiirus Ensüümid ei ole sageli puhtad polüpeptiidid vaid vajavad funktsioneerimiseks täiendavaid komponente- kofaktoreid Kofaktorid võivad olla Orgaanilised molekulid Organometallilised molekulid Koensüümid Metalli ioonid Prosteetiline rühm- kovalentselt seotud koensüüm Holoensüüm- täielik katalüütiliselt aktiivne valk (koosneb valgulisest osast ehk apoensüümist ja kofaktoritest)

7. Ensüümid kui bioloogilised katalüsaatorid • Ensüümid on tavaliselt valgud (suur Mw) • Suur reaktsioonikiirus (106…1012 korda kiirem kui ilma katalüüsita) • Pehmed reaktsioonitingimused • Reaktsioonide suur spetsiifilisus • Reguleeritavus Trioosfosfaadi isomeraas 4.3x10-6 4300 KarboksüpeptidaasA 3.0x10-9 578 S. aureuse nukleaas 1.7x10-13 95 Temp <100oC, pH7, 1 atm Alaniini aminotransferaas: Produktiks (substraadiks) alati L-alaniin, mitte D-alaniin Fruktoos-6-fosfaadi fosforüleerimine PFK poolt: reguuleeritud ATP, F2,6P, Pi, tsitraadi jt. madalmolekulaarsete ühendite poolt

8. Ensüümide klassifikatsioon ja nomenklatuur • Oksüreduktaasid Redoksreaktsioonid • Transferaasid Funktsionaalsete rühmade ülekanne • Hüdrolaasid Hüdrolüüs • Lüaasid Kaksideme tekkega seotud eliminatsioon • Isomeraasid Isomerisatsioon • Ligaasid ATP hüdrolüüsiga seotud sideme moodustamine Süstemaatiline: karboksüpeptidaas A peptidüül-L-aminohappe-hüdrolaas EC 3.4.17.1 Ensüümi nimetus: substraat(+aas) või (+protsess aas) ureaas alkoholi dehüdrogenaas Triviaalnimetused katalaas

9. Substraadi spetsiifilisus • Substraadi suhtes on ensüümid erineva spetsiifikaga: • Absoluutse spetsiifikaga- reageerib ainult üks substraat • Grupispetsiifilised- reageerivad teatud funktsionaalset rühma sisaldava substraadiga • Sideme spetsiifilised- reaktsiooniks vajalik teatud sideme tüüp • Stereokeemiline spetsiifika (L-D vormi suhtes) Ensüümide spetsiifilisus tagatakse substraadi spetsiifilise sidumisega -geomeetriline komplementaarsus -elektroonne komplementaarsus -indutseeritud struktuursed muutused -võtme-luku mudel, E. Fischer 1894!

10. Substraadi spetsiifilisusII: stereospetsiifilisus

11. Substraadi spetsiifilisus IIIgeomeetriline spetsiifilisus

12. Keemilise kineetika põhimõtetest I R P Bimolekulaarne reaktsioon k A+B P d[P]/dt=k[A][B] v=-d[R]/dt = d[P]/dt v=k[R] -d[R]/dt=k[R] Teist järku reaktsiooni korral on poolestusaeg sõltuv reagentide algkontsentratsioonist Sageli lihtsustatakse bimolekulaarsete reaktsioonide kineetika uurimisel tingimusi nii et näit. [A]>>[B], sel juhul [A]=const ja reakts kiirus sõltub ainult [B]-st. Seega on reaktsioon näiliselt 0 järku A suhtes, ehk tegu on pseudo esimest järku reaktsiooniga. Esimest järku reaktsioonid, k ei sõltu aine kontsentratsioonist, võib aga sõltuda pHst, temperatuurist, katalüsaatorist. k1 R P k-1 d[R]/dt=-k1[R]+k-1[P] Tasakaaluolekus k1[R]=k-1[P] Keq= [P]/ [R]= k1/ k-1

13. Ensüümide kineetilised omadused Katalüsaatorita toimivad reaktsioonid Reaktsiooni kiirus suureneb kontsentratsiooni kasvades Ensümaatilised reaktsioonid Reaktsiooni kiirus kasvab samuti substraadi kontsentratsiooni kasvades aga ainult teatud piirini vmax maksimaalne kiirus vmax Millise seaduspärasuse alusel toimub produkti teke ajas ehk milline on toodud võrrandi täpne kuju? v=d[P]/dt=f([E], [S]) Reaktsiooni kiirus Substraadi kontsentratsioon

14. Michaelis-Menteni võrrand Ensümaatilise katalüüsi kirjeldava kiirusvõrrandi esialgsel kujul postuleerisid Michaelis ja Menten Lihtsamail kujul toimub reaktsioon substraadi (S) ja ensüümi (E) osalusel nii, et alguses moodustub ensüüm-substraat kompleks (ES) See kompleks laguneb järgnevalt produktiks (P) ja vabaks ensüümiks või siis tagasi substraadiks (S) k-1 d[P]/dt=k2[ES] E + S ES P + E k1 k2 d[ES]/dt=k1[E][S]-k-1[ES]-k2[ES]

15. Lihtsustused Michaelis-Menteni võrrrandi tuletamiseks • Tasakaalulise kompleksi moodustamise eeldus • k-1>>k2 ehk k-1/ k2 =[E][S]/[ES]=Ks • ES- Michaelise kompleks • Statsionaarse oleku eeldus • (tingimustes [S]>>[E]) • d[ES]/dt=0 k-1 E + S ES P + E k1 k2

16. Michaelis-Menteni võrrrandi tuletamine Eksperimentaalselt mõõdetav [E]T=[E]+[ES] Kombineerime d[ES]/dt=k1[E][S]-k-1[ES]-k2[ES] ja d[ES]/dt=0, k1[E][S]=k-1[ES]+k2[ES], asendame [E]= [E]T-[ES] ja jagame([E]T-[ES])[S]/[ES]= (k-1+k2)/k1 (k-1+k2)/k1=Km Michaelise konstant Km[ES]= ([E]T-[ES])[S], ehk [ES]= [E]T[S]/(Km+[S]) ja v0=k2 [E]T[S]/(Km+[S]) v0 – algkiirus, ei arvestata pöördreaktsiooni, produktinhibitsiooni ja ensüümi inaktivatsiooni

17. Michaelis-Menteni võrrrandi tuletamine II v0=k2 [E]T[S]/(Km+[S]) Vmax realiseerub siis kui [E]T=[ES], siis Vmax=k2 [E]T, asendades saame v0= Vmax[S]/(Km+[S]) – see on Michaelis Menteni võrrand, ensüümkineetika põhivõrrand. Kirjeldab ensüümreaktsiooni kiiruse sõltuvust substraadi kontsentratsioonist Vmax[S] Vo = Km + [S]

18. Konstandi Km sisuline tähendus (k-1+k2)/k1=Km Michaelise konstant Kui [S]=Km, siis v0=1/2 vmax Ehk Km on substraadi kontsentratsioon, mille juures reaktsiooni kiirus on pool maksimaalsest Mida väikesem on Km, seda madalama substraadi kontsentratsiooni juures ensüüm efektiivselt töötab Km sõltub substraadist, ensüümist, pHst, temperatuurist NB! Mis sisu omandab Km sõltuvalt k1, k-1, k2 suhetest??? Kui k-1>>k2, siis Km=k-1/k2 Sellisel kujul on Km ES kompleksi dissotsiatsiooni-konstant k-1 v E + S ES P + E vmax k1 k2 Vmax/2 Vmax[S] Vo = 0 0 Km 2Km 3Km 4Km Km + [S] [S]

19. Valik Michaelise konstandi Km ja kcat reaalseid väärtusi

20. Katalüütiline konstant kcat ja selle sisu Defineerime kcat=Vmax/[E]T st. katalüütilise konstandi kui ensüümi molekuli kohta konverteeritavate substraadi molekulide arvu Lihtsa MM kineetikaga reaktsiooni korral kcat=k2 Olukorras kus [S]<<Km, moodustub vähe ES ja [E]=[E]T. Siis v0=k2/Km[E][S], mis on teist järku reaktsiooni võrrand, kus k2/Km on vastava reaktsiooni kiiruskonstant. See suhe on ensüümi efektiivsuse mõõduks madalal substraadi kontsentratsioonil, nimetatakse ka spetsiifilisuse konstandiks. Ülemine piir sellele konstandile on limiteeritud difusiooniga ja on 108-109 1/Ms k-1 E + S ES P + E k1 k2 Vmax[S] Vo = Km + [S]

21. Kineetiline eksperiment ja andmete analüüs Lihtsaim küsimus: Kas antud reaktsioon on kirjeldatav Michaelis-Menteni kineetilise mudeli alusel. Millised on parameetrite vmax ja Km väärtused. Mõõdetakse rida v0 väärtusi sõltuvalt [S], näiteks vahemikus 0.5Km…5Km. Andmete töötluse saab läbi viia topeltpööratud teljestikus 1/v0 ja 1/[S]. v0= Vmax[S]/(Km+[S]) Statsionaarse oleku kineetiline analüüs ei võimalda põhimõtteliselt üheselt determineerida reaktsiooni mehhanismi, samas võimaldab selline analüüs välistada alternatiive, mis ei ole andmetega kooskõlas.

22. Ensüümide aktiivsust mõjutavad faktorid Temperatuuri optimum on tavaliselt 25-40oC vahel aktiivsus Temperatuur pH Kofaktorid Inhibiitorid-aktivaatorid to toopt Ensüümide aktiivsus langeb alati optimaalsest temperatuurist kõrgemal Mõnede ensüümide pH optimumid koliinesteraas pepsiin Pepsiin magu 1.5 Sahharaas soolestik 6.2 Katalaas maks 7.3 Ribonukleaas pankreas 7.8 Arginaas maks 9.7 Aluseline fosfataas E. coli 9.8 aktiivsus trüpsiin 7.5 1.5 pH

23. Ensüümreaktsioonide mehhanism ja spetsiifika • Ensüümkatalüüsitud reaktsioon läbib järgmised etapid: • Ensüüm ja substraat moodustavad kompleksi • Kompleks läbib üleminekuoleku • Moodustub ensüümi ja produkti kompleks • Ensüüm ja produkt dissotseeruvad Ensüümid on tüüpiliselt suured valgud, ent vaid osa molekulist võtab aktiivselt osa katalüüsist Aktiivtsentris eristatakse järgmisi komponente katalüütiline tsenter (sait) sidumistsenter (sait) Katalüütiline tsenter- reaktsiooni toimumise koht Sidumistsenter-koht, kus substraat kinnitub ensüümile Ensüümid hoiavad substraati nõrkade mittekovalentsete jõududega, mille kujunemisel sageli osalevad aminohapete kõrvalahelad Substraadi ja ensüümi kujud on komplementaarsed Katalüütiline ja sidumistsenter paiknevad sageli ensüümi pinnal taskukeses või vagumuses

24. Kofaktorid ja koensüümid • Kofaktor- ensüümiga kompleksis olev aktiivsuseks vajalik väike molekul • Metalliioonid • Koensüüm- väike orgaaniline molekul • Kosubstraat- ainult ajutiselt ensüümiga seotud • Prosteetiline rühm- permanentselt valguga assotsieerunud, sageli kovalentselt • Holoensüüm-apoensüüm • Koensüümid tuleb regenereerida • Vitamiinid on sageli koensüümide eellasteks

25. Olulisemad koensüümid Biotsütiin karboksüleerimine biotiin Koensüüm A atsüülrühma ülekanne pantotenaat Koobalamiin ko. alküleerimine B12 Flaviin koensüüm. Redoksreaktsioonid B2 Lipoehape atsüülrühma ülekanne Nikotiinamiid ko. Redoksreaktisoonid niatsiin Püridoksaalfosf. Aminorühma ülekanne B6 Tetrahüdrofolaat 1C rühmade ülekanne foolhape Tiamiinpürofosfaat aldehüüdrühma ülek. B1

26. Ensümaatilise katalüüsi mehhanismid • Hape-alus katalüüs • Kovalentne katalüüs • Metallioon katalüüs • Elektrostaatiline katalüüs • Läheduse ja orientatsiooni effektid • Ülemineku oleku eelistatud sidumine Keemiline formalism reaktsioonide kujutamisel

27. Hape-alus katalüüs Happeline katalüüs- prootoni liitmine alandab üleminekuoleku vabaenergia taset, st kiirendab reaktsiooni Aluseline katalüüs- prootoni loovutamine alusele kiirendab reaktsiooni • Sageli esinevad mõlemad koos • Prootoni doonor-akseptor peaks omama pKa väärtust füsioloogilises pH piirkonnas • Asp 3.9 Glu 4.07 • His 6.04 Cys 8.37 • Tyr 10.46 Lys 10.54 • pH mõju • Substraadi sidumine • katalüüsis osalevate rühmade ionisatsioon • substraadi ionisatsioon • valgu struktuur

28. Ribonukleaas A • RNaasA katalüüsimehhanismi toetavad andmed: • Tsüklilised nukleotiidid • pH sõltuvus (pK 5.4 ja 6.4) • Röntgenstruktuuranalüüs

29. Kovalentne katalüüs Kovalentsel katalüüsil moodustub ajutine katalüsaatori-substraadi vaheline kovalentne side Ensüümi koosseisu kuuluv nukleofiilne rühm reageerib substraadiga nii et tekib kovalentne side Tekkiv vaheühend on kõrge reaktsioonivõimega Tüüpiline näide: seriinproteaasid

30. Olulisemad nukleofiilid ja elektrofiilid biokeemias

31. Katalüüs metallioonide poolt Metalloensüümid- sisaldavad tugevalt seotud metalliooni Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Co2+ Metallide poolt aktiveeritavad ensüümid seovad lahusest metalliooni nõrgalt Ca2+, Mg2+, Na+, K+ • Substraadi sidumine • Redoksreaktsioonid • Negatiivsete laengute varjestamine.

32. Elektrostaatiline katalüüs • Aktiivtsentris tüüpiliselt vesi puudub ja elektrostaatilised interaktsioonid seetõttu tugevad • Laengujaotus aktiivtsentris on selline, et tavaliselt stabiliseeritakse üleminekuolekut.

33. Lähedus- ja orientatsiooni effektid • Toimivad tänu substraatide sidumisele ensüümide poolt • Viivad lähedasse kontakti substraadi(d) ja katalüütilised rühmad • Substraadid asetuvad ruumis reaktiivses orientatsioonis, fikseeritud olles piiratud translatsioonilise ja rotatsioonilise liikuvusega

34. Üleminekuoleku tugevam sidumine ensüümi aktiivtsentrisse

35. Üleminekuoleku analoogid- ensüümide tugevad inhibiitorid

36. Näide ensüümkatalüüsi mehhanismist I: seriinproteaasid Kümotrüpsiin, trüpsiin, elastaas; NB! Subtilisiin ja seriini karboksüpeptidaas II Nimetus: aktiivtsentris reaktiivne Ser jääk, modifitseeritav DIPF jt fluoroorgaaniliste ühenditega. Aktiivtsentris 3 invariantset jääki Ser195, His57 ja Asp102 (kümotrüpsiini molekuli numbrid) : katalüütiline triaad Aktiivtsentris spetsiifilisuse sait, mis määrab ära vastava proteaasi spetsiifilisuse

37. Näide ensüümkatalüüsi mehhanismist II: seriinproteaasid II katalüüs • Substraadi sidumine • Karbonüülrühma nukleofiilne atakk Ser195 poolt. Tetraeedrilise intermediaadi I moodustumine. Ser OH prooton seotakse His 57 poolt, mida soodustab Asp 102 elektrostaatiline interaktsioon • TI I seotakse oksüanioonaugus konformatsiooniliste muutuste tagajärjel kahe H sideme osalusel. Samuti moodustuvad H sidemed ensüümi ja substraadi molekulis eelneva NH sühma vahel. • TI I laguneb ensüüm-atsüül intermediaadiks, happelise katalüüsi tulemusel. H doonoriks His 57. Lahkub amiin koos polüpeptiidiga, aktiivtsentrisse tungib vee molekul. • Atsüül- ensüüm intermediaat hüdrolüüsitakse, vasi on atakeerivaks nukleofiiliks, Ser 195 lahkuv rühm. Produkt vabaneb. Ensüümi aktiivtsenter regenereerub esialgsel kujul.

38. Kümotrüpsiini ja teiste seriinproteaaside katalüüsi mehhanism

39. Ensüümide inhibeerimine Ensüümide aktiivsust võivad inhibeerida mitmesugused substantsid substraadi analoogid, toksiinid ravimid, metallide ioonid jt. • Mis kasu annab inhibiitorite uurimine? • Võimaldab uurida metaboolseid radasid • Võimaldab aru saada ravimite ja toksiinide toimemehhanismist • On võimalik aru saada ensüümide töötamise printsiipidest

40. Pöörduvad ja pöördumatud inhibiitorid Vastavalt inhibiitori ja ensüümi vahelise interaktsiooni tugevusele liigitaatkse inhibiitorid 2 klassi pöördumatud inhibiitorid moodustavad kovalentse või väga tugeva mittekovalentse sideme ensüümiga. Side moodustub aminohappega, mis osaleb normaalselt ensümaatilises reaktsioonis Pöörduvad inhibiitorid moodustavad nõrga mittekovalentse sideme ja on võimelised kompleksist dissotseeruma. Ensüüm on inaktiivne ainult siis, kui me lahusest inhibiitorit ei eemalda.

41. Pöörduvad inhibiitorid jaotatakse omakorda: konkurentsed mittekonkurentsed ebakonkurentsed Konkurentne inhibiitor- sarnaneb normaalsele substraadile ja konkureerib sellega samasse tsentrisse sidumise pärast Mittekonkurentne inhibiitor- seonduvad mitte aktiivtsentrisse vaid kuhugi mujale, aga mõjutavad sellega ensümaatilist aktiivsust Ebakonkurentne inhibiitor- sarnanevad mittekonkurentse inhibiitoriga, ent seonduvad ainult ES kompleksiga. substraat substraat substraat Konkurentne inhibiitor mittekonkurentne inhibiitor ensüüm ensüüm ebakonkurentne inhibiitor ensüüm

42. Konkurentse inhibiitori mõju Km ja vmax väärtustele Konkurentne inhibiitor- konkureerib substraadiga ensüümile sidumises Mõju avaldub aktiivse substraadi seondumises osaleva ensüümi kontsentratsiooni alanemises; vmax jääb samaks, Km suureneb Km*=aKm a=1+[I]/Ki

43. Mittekonkurentse inhibiitori mõju Km ja vmax väärtusele Segatüüpi ehk mittekonkurentne inhibitsioon Seondub nii vaba ensüümiga kui ensüüm-substraat kompleksiga Mõjutab nii substraadi sidumist kui katalüüsi

44. Ebakonkurentse inhibiitori mõju Km ja vmax väärtustele Ebakonkurentne inhibiitor, seondub ES kompleksiga, ei seondu vaba ensüümiga. Seega ei sega ES kompleksi moodustumist vaid ainult katalüüsi.

45. Atsetüülkoliinesteraas ja närviimpulsi ülekanne Atsetüülkoliinesteraas on ensüüm, mis on vajalik närviimpulsi neuromuskulaarseks ülekandeks Närvisignaali saabumisel tõuseb Ca2+ tase Ca2+ taseme tõus põhjustab atsetüülkoliini sisaldavate vesiiklite liikumise närvirakku lõppu ja atsetüülkoliini vabanemise Atsetüülkoliin difundeerub läbi sünapsi ja kannab signaali lihasele üle Signaali peatamiseks hüdrolüüsitakse atsetüülkoliin reaktsioonis, mida katalüüsib atsetüülkoliinesteraas atsetüülkoliinesteraas atsetüülkoliinesteraasi retseptor Atsetüülkoliini olemasolul retseptoril toimub Na+ ja K+ ioonide liikumine läbi membraani näidatud suunas. See põhjustab lihaste kokkutõmbumise

46. Atsetüülkoliinesteraas ja närviimpulsi ülekanne Ilma atsetüülkoliinesteraasita ei peatu lihaste kontraktsioon, tekivad krambid Atsetüülkoliinesteraasi inhibiitorid on kasutusel kui ravimid ja mürgid Orgaanilised fluorofosfaadid Seonduvad ensüümiga pöördumatult. Kasutusel sõjagaasidena Suktsinüülkoliin Konkurentne atsetüülkoliini inhibiitor. Kasutusel lihaseid lõdvestava preparaadina

47. Ensümaatilised substraadi määramise meetodid Kliinilises ja biotehnoloogilises praktikas kasutatakse sageli metaboliitide määramiseks ensümaatilisi meetodeid Ensümaatilise meetodi korral tuleb tähelepanu pöörata kõigile faktoritele, mis mõjutavad ensüümide aktiivsust: temperatuur, pH jt faktorid tuleb hoida konstantsetena Faktorid, mis konkureerivad substraadi või ensüümiga tuleb eemaldada või äärmisel juhul hoida konstantsel tasemel Tuleb jälgida produktide edasist konversiooni kas ensümaatiliselt või spontaansete reaktsioonide tulemusel jne

48. Substraadi määramise analüütilised meetodid • Kaks erinevat lähenemist substraadi hulka produkti kaudu mõõtes. • Lisada piisavalt suur hulk ensüümi ja lasta reaktsioonil lõpuni kulgeda. Siis määrata tekkinud produkti hulk. • Lähenemise puuduseks on kasutatava ensüümi suur hulk • Kineetiline meetod. Lisada väike hulk ensüümi ja määrata reaktsiooni algkiirus

49. Näide 1. Karbamiidi (uurea) määramine Karbamiidi määratakse kasutades hüdrolüüsi ureaasiga. ureaas NH2CONH2 + 2H2O + H+Z 2NH4+ + HCO3- Mõõta on võimalik lihtsalt: H+ NH4+ HCO3- Kõik on pH sõltuvad! Lihtne on mõõta pH-d kasutades pH elektroodi. H+ kasutamisega aga muutub reaktsiooni kiirus. Sellist tiitrimist on võimalik teha pH-staadiga, so instrumendiga, mis hoiab pH konstantsena.

50. Näide 2: Glükoosi määramine Kliinilises praktikas väga oluline reaktsioon oksüdaas Glükoos + H2O + O2Z glükoonhape + H2O2 Reaktsiooni on võimalik jälgida kas H2O2 või O2 tekke järgi. Peroksiidi ei saa mõõta lihtsate vahenditega otseselt. Detekteeritavate ainete tekitamiseks kasutatakse seetõttu konjugeeritud ehk seostatud reaktsiooni H2O2 + värvredutsZ H2O +värvox peroksüdaas Oksüdeerunud värvi on võimalik mõõta ja selle hulk on proportsionaalne reageerinud glükoosi hulgaga O2 mõõtmine- polarograafiliselt Hapniku kontsentratsioon määratakse elektroodiga, kasutades reaktsiooni O2 + 4H+ + 4e-Z H2O Väga väike hulk lahuses olevat hapnikku reageerib ja tingimused seetõttu ei muutu oluliselt. Lahus ei tohi olla kiires tasakaalus atmosfääriga usaldusväärsete tulemite saamise jaoks. Sellel printsiibil töötavad kommertsiaalsed glükoosi analüsaatorid