SECRETARIA SECCIONAL DE SALUD Y PROTECCIÓN SOCIAL DE ANTIOQUIA CONVENIO ICMT/UNIVERSIDAD CES

1. El laboratorio y su apoyo al evento de la Leptospirosis humana SECRETARIA SECCIONAL DE SALUD Y PROTECCIÓN SOCIAL DE ANTIOQUIA CONVENIO ICMT/UNIVERSIDAD CES María Cecilia Ospina Mejía Bacterióloga-contratista SSS y PSA-ICMT-CES Grupo de Microbiología Laboratorio Departamental de Salud Pública Diciembre 3 de 2011

2. La Leptospirosis como evento de vigilancia de salud pública requiere • Un alto grado de sospecha • Una historia clínica precisa • Un buen examen físico y… • la confirmación diagnóstica por laboratorio Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

3. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

4. CLASIFICACIÓN • Su nombre deriva de la palabra lepto que significa "espiral delgada o fina". • Familia: Leptospiraceae • Orden: Spirochaetales • Género: Leptospira • Especies: L interrogans - L. biflexa. • L. interrogans, con más de 218 serovares , incluye microorganismos patógenos tanto para animales domésticos y salvajes como para el hombre. • L .biflexa, con al menos 60 serovares reconocidos,comprende microorganismos saprófitos de vida libre que habitan ambientes húmedos y no producen enfermedades Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

5. MORFOLOGÍA • Aerobios estrictos • Oxidasa positivos • Catalasa positivos. • Miden de 6 a 20 micras de longitud y 0,1 micras de diámetro. • Tienen dos filamentos axiales independientes. • Extremos del organismo está curvado en forma de gancho. • No crecen en medios ordinarios de cultivo, pero sí lo hacen, en medios enriquecidos con suero de conejo o en medio Tween 80-Albumina a un pH de 7.2-7.4 (como el Stuart, EMJH o Korthoff) • Son delgados, flexibles y enrollados en forma helicoidal. • La pared es similar a la de otros Gram negativos, con una fina capa de peptidoglicano y una membrana externa con lipopolisacáridos de poca actividad endotóxica. • Son móviles por rotación Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

6. FISIOLOGÍA La supervivencia de las leptospiras fuera del huésped es favorecida por temperaturas mayores o iguales a 22ºC; humedad adecuada y un medio ambiente neutro o levemente alcalino; es resistente al frío (no perece en las neveras). Son muy lábiles a altas temperaturas, a la desecación, los medios ácidos y los detergentes. Todo esto hace que exista una mayor posibilidad de contagio durante los meses lluviosos. No se propaga de una persona a otra, aunque en raro casos sí se ha comprobado. Su extraordinaria movilidad sobre su eje le asegura un alto poder invasivo, Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

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8. Diagnóstico de Leptospirosis Anticuerpos específicos anti-Leptospira Demostración del microorganismo en espécimen clínico • Microscopia de campo oscuro • Inmunofluorescencia directa • Las tinciones de plata en tejidos fijados • Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) • Cultivo -Elisa IgM para Leptospira - Técnica de aglutinación de microcápsula (MCAT) -La prueba de microaglutinación (MAT): Detecta el serogrupo infectante -Lepto-Dipstick (ELISA) Exámenes complementarios • Hemoleucograma y recuento de plaquetas • Aminotransferasas • Bilirrubinas • BUN y creatinina • CPK Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

9. Demostración del microorganismo en espécimen clínico • Microscopía de campo oscuro: en contraste de fases, de sangre, orina o LCR ha sido utilizado, pero tiene baja sensibilidad y especificidad • -Inmunofluorescencia directa en muestras de sangre u orina • -Las tinciones de plata en tejidos fijados • -Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):la amplificación del ADN se ha convertido en una excelente ténica diagnóstica, debido a la rapidez con que provee el resultado y a su alta sensibilidad. Estos métodos permiten diferenciar leptospiras patógenas de saprofitas, así como también identificar el serovar infectante, cuando se combinan con otros métodos como el análisis con enzimas de restricción o secuenciación directa de amplicones. • -Cultivo en el medio semisólido Fletcher, a partir de muestra de sangre, orina y LCR durante el periodo febril;y monitoreados por lo menos por 8 a 12 semanas (método caro y laborioso). La viabilidad de las leptospiras en la orina humana y de los animales domésticos es limitada, por lo que se debe procesar inmediatamente Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

10. Demostración de anticuerpos • Las pruebas serológicas son el método más práctico para el diagnóstico; todas con capacidad de detectar anticuerpos IgM, permitiendo un diagnóstico temprano de la enfermedad, con la ventaja adicional de detectar anticuerpos anti-leptospiras, independientemente del serogrupo infectante. 1) Técnica ELISA IgM para leptospira: Marca:PANBIO Procesamiento: de acuerdo con las especificaciones descritas en el inserto del kit ELISA LEP01M05 ELISA IgM Aplicación: cómo prueba de tamizaje útil en el diagnóstico temprano una infección por Leptospiras Condición: usar la prueba tamiz con la subsecuente confirmación por MAT Para la detección de anticuerpos como prueba de referencia (gold estándar) se usa la prueba de microaglutinación Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

11. 1) Técnica ELISA IgM para leptospira: Ventajas - Detectar leptospirosis precoz - Los anticuerpos de tipo IgM son los que se presentan en una reciente infección - Es aplicable en diferentes zonas a temperaturas diferentes - Los reactivos son estables por largos períodos Requerimientos - Sospecha de Leptospirosis (ver Protocolo del INS) - Tomar muestras de sangre sin anticoagulante y extraer el suero (libre de hemólisis) en dos momentos: la primera después del 5 al 10 día de detectado el paciente sospechoso y una segunda muestra entre los 15 y 20 días después de haber tomado la primera muestra. -Rotular las muestras con nombre e identificación del paciente - Enviar al Laboratorio la muestra de manera refrigerada conservando las normas de bioseguridad - Acompañar la muestra con la ficha clínico epidemiológica completamente diligenciada. - La muestra debe ser tomada sin antibioticoterapia previa a las 72 horas de la toma y especificando primera y segunda muestra. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

12. 1) Técnica ELISA IgM para leptospira: Descripción Los anticuerpos contra leptospira en el suero, se combinan con el antígeno de leptospira (antígeno total) fijado a la superficie de los micropocillos de poliestireno. El suero residual es removido por medio de lavados y luego es añadido el conjugado anti-humano IgM ligado a una enzima (peroxidasa). Posterior a la incubación, los micropocillos son lavados y se añade el sustrato (peróxido de hidrógeno) más un cromógeno. El sustrato es hidrolizado por la enzima y el cromógeno varía de color, la reacción se detiene por la adición de una solución de pare. La intensidad de color está directamente relacionado con la concentración de anticuerpos contra leptospira presentes en la muestra. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

13. 1) Técnica ELISA IgM para leptospira: Con relación a la muestra… Toma y envío de muestras para Elisa IgM y MAT Momento de la toma: Las leptospiras usualmente circulan en la sangre del paciente por aproximadamente 10 días después de la aparición de la enfermedad. Por lo tanto la detección de anticuerpos aparecen en la sangre de 5 - 10 días después de la aparición de la enfermedad aunque algunas veces pueden tardan más, especialmente si se implementó tratamiento con antibióticos. Primera muestra a los 5 días de inicio de síntomas -Suero separado a partir de muestra de sangre extraída de en tubo seco sin anticoagulante -libre de hemólisis Segunda muestra -Igual condición pero a los 15 días de enviada la primera, para verificar seroconversión.-Los sueros deben enviarse rápidamente de forma refrigerada -Acompañar las muestras ficha completamente diligenciados datos clínicos, paraclínicos y epidemiológicos según el protocolo Muestras postmortem: obtenidos asépticamente y tan pronto como sea posible después de la muerte; deben ser inoculadas en el medio de cultivo lo más rápido que se pueda. Las muestras deben ser guardadas y transportadas a + 4°C, previniendo la autolisis de las células a 4°C y una consecuente disminución del pH, lo que compensará la reducción en la viabilidad de las leptospiras patógenas a bajas temperaturas Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

14. Demostración de anticuerpos 2) Test de Microaglutinación (MAT) Test de Aglutinación Microscópica con Antígenos vivos “Gold standard” Procesada por INS Es la prueba de referencia de la Organización Mundial de la Salud Técnica confirmatoria: aglutinación microscópica con antígenos vivos , pone de manifiesto la presencia de anticuerpos anti-leptospira en el suero del paciente: es una prueba muy compleja. Requerimiento: Suero sanguíneo libre de hemólisis, -envío con dos muestras pareadas En el INS están utilizando, 16 grupos y 28 serover (ver tabla) Todos los resultados positivos deben ser confirmados por MAT. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

15. ALGORITMO DEL SERODIAGNOSTICO DE LEPTOSPIROSIS Nota: Resultado positivo de anticuerpos IgM por técnica de ELISA en muestras pareadas: Confirmación del Caso Protocolo actualizado del INS.

16. Interpretación de la prueba de MAT-Leptospira

17. Exámenes complementarios • Leucocitosis • Leucopenia • Neutrofilia • Neutropenia • Linfocitosis • Trombocitosis • Trombocitopenia • Hemoconcentración • Alteración de las aminotranferas • Alteración de las bilirrubinas • Alteración de BUN • Alteración de la cratinina • CPK elevada Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

18. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

19. Para establecer el diagnóstico diferencial (Dengue, Hepatitis Virales, Malaria, fiebre amarilla, Meningitis asépticas, Bronconeumonías, entre otras)  Ordenar la prueba de Elisa IgM para Leptospira , a los pacientes que cumplan criterio (clínica + factores de riesgo) y que tenga algunos de estos síntomas: Fiebre (38º o más) , mialgias, cefalea repentina, artralgias, vómito, Náuseas, dolor retrocular, hiperemia conjuntival, secreción conjuntival, dolor en pantorrillas, diarrea, dolor abdominal, hemoptisis, melenas, epistaxis, erupción, hematuria, prueba de torniquete positiva, esplenomegalia, signos meníngeos, disnea, tos, insuficiencia respiratoria, hepatomegalia, Ictericia, insuficiencia hepática, insuficiencia renal, repentina, Insuficiencia renal, Inyección bilateral conjuntival, Neumonía, Hemorragia pulmonar , entre Otros.(ficha 455) Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

20. El tratamiento siempre se administrará con un diagnóstico presuntivo sin esperar la confirmación por laboratorio y de acuerdo al estado del paciente con antibióticos de primera elección. El médico tratante, debe informar al paciente sobre la enfermedad, las posibles fuentes de infección, las recomendaciones, cuidados y la necesidad de tomar la segunda muestra 15 a 20 días después de la toma inicial para la confirmación de la infección. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

21. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

22. -Todas las Unidades Primarias Generadoras de datos-UPGD- deben notificar todos los casos semanalmente a la unidad notificadora municipal para el registro en el SIVIGILA, además se deben y realizar los ajustes pertinentes dentro de las 4 semanas siguientes a la notificación inicial. -El laboratorio clínico debe tomar y procesar las muestras de suero para detección de anticuerpos IgM mediante la pruebas tamiz e informar el resultado al médico tratante y al área de vigilancia epidemiológica de la institución. -Las muestra que procesen los laboratorios deben ser remitidas al Laboratorio departamental de salud pública (LDSP) para el proceso de control de calidad. - En caso de que el paciente no acuda a la toma de la segunda muestra el laboratorio debe dar conocimiento de la situación a epidemiología de la institución para hacer seguimiento y captación del caso para garantizar la recolección de la segunda muestra. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

23. Los días y el horario de recepción de muestras es de lunes a viernes de 7:30 a.m a 4:30 p.m. Su procesamiento se realiza todos los Viernes (cuando hay demanda los martes) Deben enviarse refrigerados El médico tratante debe diligenciar la ficha 455 completa, especificando la fecha de inicio de síntomas, las manifestaciones clínicas relacionadas, antecedente de viajes en los 15 días anteriores a la fecha de consulta, posibles fuentes de infección (animales y medio ambiente), además de la identificación de otros individuos con la misma sintomatología. El médico tratante está en la obligación de diligenciar las fichas de notificación con letra clara y legible, en su totalidad y enviarla al área de epidemiologia de la institución para seguir el flujo de la notificación Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

24. Laboratorios Departamentales de Salud Pública (LDSP) • * Recibir y remitir al laboratorio del grupo de microbiología del Instituto Nacional de Salud las muestras de suero pareadas de los casos sospechosos de leptospirosis que presenten un resultado positivo de anticuerpos IgM por técnica de ELISA para realizar la prueba de oro, microaglutinación (MAT). Dichas muestras deben ser enviadas de forma obligatoria con la Ficha Única de Notificación Obligatoria de Leptospirosis ya que ninguna muestra será procesada en el laboratorio nacional si no son derivadas del proceso de vigilancia rutinaria del evento. • Realizar el control de calidad pertinente a los laboratorios de diagnóstico en su jurisdición y realizar un informe de retroalimentación con los resultados a los laboratorios evaluados. • * Participar en el programa de control de calidad que realiza el grupo de microbiología de la Red Nacional de Laboratorios. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

25. DEFINICIÓN DE CASO • Confirmado por Laboratorio • Paciente con signos o síntomas compatibles con el caso sospechoso que sea confirmado por alguno de los siguientes criterios de laboratorio: • Resultado positivo de anticuerpos IgM por técnica de ELISA en muestras pareadas • Seroconversión en muestras pareadas mediante microaglutinación (MAT) • Títulos de MAT iguales o mayores de 1:400 en la primera muestra en los casos fatales. • Cultivo • Aislamiento de Leptospira spp en sangre, orina o LCR, tomado antes del inicio del tratamiento antibiótico. • Pruebas moleculares • Detección de ADN mediante PCR • Para todo caso de mortalidad • Inmunofluorescencia o coloración de plata positiva en muestras de hígado, riñón y pulmón. • Hallazgos histopatológicos compatibles. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

26. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

27. Distribución porcentual de resultados de prueba ELISA IgM para Leptospira, LDSP, Antioquia 2010. • 32 duplicados y triplicados, lo que deja solo 264 de 296 muestras. • Muestras pareadas: 85 • Con prueba de MAT: 159 (Antes se hacía a una sola, con el nuevo protocolo solo se hace a las muestras pareadas. De esos 16 eran Pareados) • Muestras triplicadas: 2 no cumplen criterio para MAT en tres días seguidos. • Muestras duplicadas: 17 (desde una por la mañana y otra por la tarde hasta de 2, 3 y 4 días después de enviada la primera) Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

28. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados por la prueba de ELISA IgM por grupos de edad. LDSP. Antioquia, 2010. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

29. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados por la prueba de ELISA IgM por subregión. LDSP. Antioquia, 2010. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

30. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados en la región de Valle de Aburrá por la prueba de ELISA IgM por municipio. LDSP. Antioquia, 2010. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

31. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados en la región de Urabá por la prueba de ELISA IgM por municipio. LDSP. Antioquia, 2010. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

32. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados por la prueba de ELISA IgM por área. LDSP. Antioquia, 2010. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

33. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados por la prueba de ELISA IgM por reporte de síntomas. LDSP. Antioquia, 2010. Los síntomas que se registraron, correspondían a los que tenían los pacientes al momento de tomarles la muestra, o antes de consultar. Algunos pacientes consultaron dentro de los 3 y hasta 10 días de aparecidos los signos y síntomas. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

34. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados por la prueba de ELISA IgM por reporte de signos y síntomas. LDSP. Antioquia, 2010. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

35. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados por la prueba de ELISA IgM por reporte de síntomas y signos. LDSP. Antioquia, 2010. Dentro del 35.23% de los casos que reportaron, los signos y síntomas comunes fueron: Fiebre Cefalea , Mialgias, Artralgias, Adinamia , trombocitopenia, dolor abdominal, astenia, malestar general, escalofrio. También hubo clínica sugestiva de afectación de determinados órganos, son reporte de signos como ictericia y trombocitopenia. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

36. Distribución porcentual de resultados de prueba ELISA IgM para Leptospira. LDSP, Enero a Octubre de 2011. • Total muestras recibidas: 934 • Duplicados: 66 (7.1%), Triplicadas: 10 (1.1%), cuadriplicadas 2 (0.21%) (con dos días de diferencia) • Muestras pareadas :85 • Con prueba de MAT: 123 Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

37. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados por la prueba de ELISA IgM por grupos de edad. LDSP. Antioquia, Enero a Octubre de 2011. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

38. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados por la prueba de ELISA IgM por región. LDSP. Antioquia, Enero a Octubre de 2011. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

39. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados en la región de Valle de Aburrá por la prueba de ELISA IgM por municipio. LDSP. Antioquia, Enero a Octubre de 2011.. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

40. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados en la región de Urabá por la prueba de ELISA IgM por municipio. LDSP. Antioquia, Enero a Octubre de 2011. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

41. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados por la prueba de ELISA IgM por área. LDSP. Antioquia, Enero a Octubre de 2011. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

42. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados por la prueba de ELISA IgM por reporte de signos y síntomas. LDSP. Antioquia, Enero a Octubre de 2011. Dentro del 28.84% de los casos que reportaron, los signos y síntomas, las más comunes fueron: fiebre dolor Abdominal, cefalea, artralgias, escalofrío, diarrea, Mialgias, Malestar general , vómitos , entre otros. También hubo clínica sugestiva de afectación de determinados órganos, con reporte de ictericia , leucopenia, proteinuria, aumento bilirrubinas, equimosis y trombocitopenia. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

43. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

44. Distribución porcentual de los casos positivos de Leptospira detectados por la prueba de ELISA IgM por régimen de seguridad social. LDSP. Antioquia, Enero a Octubre de 2011. Preparado por María Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

45. Serotipos relevantes encontrados por MAT-INS (octubre y diciembre 2010) , en 92 resultados de pacientes con Leptospirosis IgM, con título significativo mayor o igual a 400. Antioquia. Preparado por Maria Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

46. Serotipos relevantes encontrados por MAT-INS (enero y febrero 2011)en 99 casos de Leptospirosis, IgM positiva, Antioquia. Preparado por Maria Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

47. Correlación cruce de información de base de datos Leptospira VS Dengue Enero a 15 de Septiembre de 2011 La dificultad para diferenciar clínicamente esta enfermedad del Dengue hace que no se determine o sea subregistrada,pues ambas enfermedades coinciden en tiempo y espacio De las 762 muestras analizadas para Leptospira en el periodo mencionado, 227 (29.8%) muestras tenían Dengue IgM Preparado por Maria Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

48. Coinfección Leptospira / Dengue. Antioquia, Enero a Sept 15 de 2011. Leptospira Negativa Leptospira Positiva Leptospira Zona Gris Preparado por Maria Cecilia Ospina M. Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

49. Bibliografia • OMS. Normas de vigilancia recomendadas por la Organización Mundial de la Salud. WHO/EMC/DIS/97.1. Ginebra,1997. • http://www.medicinapreventiva.com.ve/articulos/leptospirosis.htmLeptospirosis humana: guía para el diagnóstico, vigilancia y control / Organización Mundial de la Salud; traducción del Centro Panamericano de Fiebre Aftosa. - Rio de Janeiro: Centro Panamericano de Fiebre Aftosa –VP/OPS/OMS, 2008 • Leptospirosis Oficina General de Epidemiología / Instituto Nacional de Salud, Perú Evento de vigilancia: LEPTOSPIROSIS Fecha de creación: Segundo semestre de 2009 INS – Subdirección de Vigilancia y Control Página 1 de 16 • FUENTE:http://www.iaca.com.ar/leptospirosis%20humana.htm Preparado por María Cecilia Ospina . Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.

50. ¿Preguntas? ¿Comentarios? Preparado por María Cecilia Ospina . Bacterióloga. SSS y PSA - ICMT.