Hyperhomocysteinémie Homocystinurie maladie métabolique maladie conjonctive

1. Hyperhomocysteinémie Homocystinuriemaladie métaboliquemaladie conjonctive

2. Erreur innée Macromolécule conjonctive Erreur innée Métabolisme Remodelage tissulaire dégradation synthèse

3. Hyperhomocystéinémies hyperhomocystéinémie modérée intermédiaire sévère homocystinurie 0 15 20 30 40 60 80 100 µmol/L Asymptomatique Facteur de risque vasculaire Symptomatologie sévère Complications

4. Hyperhomocystéinémies proteines Ser Met THF Gly B6 SAM X 5,10-methylene THF MS B12 Me-X SAH MTHFR Hcy 5-Me THF Ser CBS B6 cystathionine Hser Cys Etiologies • Déficits enzymatiques

5. Hyperhomocystéinémies proteines Ser Etiologies Met THF Gly B6 SAM X 5,10-methylene THF X MS B12 Me-X • Déficits enzymatiques SAH X MTHFR Déficit en CBS Homozygote: très sévère B6-sensible B6-résistant Hétérozygote: modérée, discrète Déficit en MTHFR Homozygote: sévère Hétérozygote: modérée Déficit méthylation B12 intermédiaire Hcy 5-Me THF Ser X CBS B6 cystathionine Hser Cys

6. Hyperhomocystéinémies Etiologies • Déficits vitaminiques Folates, B6, B12, • Insuffisance Rénale Chronique • Facteurs iatrogènes - Antifoliques Méthotrexate, anticonvulsivants, Sulfasalazine - Anti B6 Isoniazide, Procarbazine, Cyclosérine, Azauridine - Inhibiteur MS protoxyde d’azote - Oestroprogestatifs • Excès d’apport en méthionine ?

7. Hyperhomocystéinémies Modèles animaux • Modèles génétiques • CBS • -/- survie limitée • +/- avec régime riche en Met • MTHFR +/- • Modèles diététiques Régimes riches en Met poulet pendant la croissance rat adulte porc adulte

8. Homocystinurie Symptomatologie • Lésions oculaires Ectopie du cristallin : inférieure Myopie Luxation du cristallin Diagnostic différentiel Maladie de Marfan : ectopie supérieure ou externe

9. Homocystinurie Symptomatologie • Lésions squelettiques et musculaires Aspect marfanoïde Taille élevée Extrémités longues et fines Arachnodactylie Genu valgum Déformation du sternum Ostéoporose Scoliose Hypotonie musculaire

10. Homocystinurie Symptomatologie • Lésions vasculaires Artériosclérose Athérothrombose • Atteintes neurologiques Retard mental • Autres Lésions cutanées, peau fine, pores élargies Dépigmentation Pneumothorax

11. maladie métaboliquemaladie conjonctive Clinique Histologique ? Biochimique ? Remodelages de la paroi artérielle

12. Homocystinurie – Remodelage matriciel Histological examination showed spectacular alteration of elastic structure in arteries from homocystinuric human « …extracellular matrix deposition, elastica degeneration, smooth muscle cell hyperplasia, and fibrosis. » (Gibson. 1964). « The arteriosclerotic plaques occuring in homocystinuria, whether caused by CBS deficiency, methyl transferase deficiency, or MTHFR deficiency, are typical fibrous plaques, characterized by smooth muscle cell hyperplasia, deposition of extracellular matrix and collagen, and degeneration and destruction of elastic fibers. » (McCully, 1983)

13. Hyperhomocystéinémie modérée – Dégradation des structures élastiques artérielles Coronaire Porcs adultes Régime riche en Met Controle hyperhomocysteinemie (x 2) Hyperhomocysteinemie Evènement précoce (4 mois) majeur (~50 %) Atherosclerose Orcein stained 6 µm transverse section

14. Défaut des structures élastiques artérielles - conséquences tissulaires Young animal Old animal IEL renal arteryVue ‘‘en face’’, confocal Microscopy Fenestration SMCs migration Souris KO elastine (-/-) proliferation et migration SMCs formation neointima stenose (DY. Li, 2002) Hyperhomocysteinemie proliferation SMCs Épaississement intimal

15. L’hyperhomocysteinemie induit une dégradation majeure des structures élastiques qui peut accélérer le développement de l’athérosclérose Défaut d’assemblage Dégradation des structures élastiques ?

16. Structures elastiques Fibre élastique microfibrilles fibrilline-1, -2 MAGP fibuline-1, -2 Composant amorphe: élastine

17. Hyperhomocysteinemie et élastogenèse • Synthèse et réticulation élastine :observations contradictoires • Fibrillines • In vivo : • embryon de poulet • Fib ↓ sans défaut des structures élastiques (Boot. 2004) • poulet en croissance : • Fib ↓ défaut structures élastiques (Hill. 2002) • In vitro : • Fib-1 : défaut de repliement domaines EGF (2005) • Fib-1 : dysfonction (↓ calcium binding, Hubmacher. 2005) • Proteoglycans • aggregation  perturbation interactions (McCully. 1993) Fibres élastiques anormales

18. Hyperhomocysteinemie – dégradation des structures élastiques In vivo, animal adulte • Souris ApoE -/- mice + régime riche en Met (Hoffman. 2001) • ↑ elastolyse dans aorte • Rats + régime riche en Met (Zulli. 1995) • disparition des lames élastiques aorte • Porcs + régime riche en Met : • fenestration des lames élastiques • ↓ contenu en élastine aorte abdominale et coronaire (Charpiot. 1998) Degradation structures élastiques artérielles

19. Processus Elastolytique 12 In vivo Porc + régime riche en Met * 8 Hyperhomocysteinemie modérée 4 mois 4 0 Aorte abdominale Elastin content (Vv, %) Control Hyperhcy C H Ex vivo * Culture d’explants artériels + Hcy 8 72 h 4 Aorte abdominale 50 µm 0 Hcy 10 µM 100 µM 10 100 µM Hcy

20. Processus Elastolytique In vivo * 200 Porc + régime riche en Met 100 Hyperhomocysteinemie modérée 4 mois +Phe 0 Aorte abdominale C H C H Specific elastolytic activity (AU / mg protein) * Ex vivo +Phe (phenanthroline) Inhibiteur de metalloproteinases Culture d’explants artériels + Hcy 40 72 h Aorte abdominale +Phe 0 10 100 10 100 µM Hcy

21. Processus Elastolytique MMP-dépendant GM6001, inhibiteur large spectre des MMPs previent la degradation structurale induite par Hcy 12 * 8 Elastin content (Vv, %) 4 0 Hcy 10 µM 100 µM 100 µM+ GM6001 10 100 µM Hcy 100 + GM6001

22. Balance MMP/TIMP µM Hcy µM Hcy 10 10 50 50 100 100 µM Hcy 10 50 100 MMP-9 92 kDa - - 92 kDa Specific activity (AU / mg protein) 72 kDa - MMP-2 - 72 kDa 68 kDa - - 68 kDa µM Hcy 10 50 100 Gelatin-zymographie Western Blot TIMPs ↑ MMP-2 et MMP-9 élastolytiques Inhibiteurs tissulaires inchangés TIMP-1 26 kDa - TIMP-2 22 kDa - Reverse zymographie

23. Hyperhomocysteinemie – dégradation des structures élastiques In vivo, the degradation of the arterial elastic structures induced by hyperhomocysteinemia is more marked in the inner part of the media. - In vivo in human (Mc Cully. 1983) « ...disruption of the elastic laminae, usually more marked toward the innermost elastic membrane,… » - In vivo in animal (Charpiot. 1998) Haemodynamic strains ? Endothelium ?

24. Hyperhomocysteinemie – dégradation des structures élastiques      Ex vivo, explants arteriels en culture + homocysteine ½ media 50 µm Hcy 10 µM 100 µM 6 µm transverse section. (+) catechine- stained elastic structure

25. Hyperhomocysteinemie – dégradation des structures élastiques 10 µM 10 µM 100 µM 100 µM MMPs – Expression tissulaire ↑ expression MMP-2 et MMP-9 dans la partie interne de la média… MMP -2 MMP-9 ½ media Hcy Immunohistochimie 6 µm transverse sections

26. Hyperhomocysteinemie – dégradation des structures élastiques 10 µM 10 µM 100 µM 100 µM TIMPs – Expression tissulaire expression et distributionTIMP-1 et TIMP-2 inchangées TIMP -1 TIMP-2 Hcy Immunohistochimie 6 µm transverse sections

27. Potentiel protéolytique des cellules endothéliales (µM) (µM) (µM) (µM) 10 10 10 10 50 50 50 50 100 100 100 100 250 250 250 250 200 * MMP-9 * * Activity (%) 100 92 kDa - 0 MMP-2 200 * * * 72 kDa - Activity (%) 100 0 Gelatin Zymography (Lamy. 2004)

28. Potentiel protéolytique des cellules endothéliales Western Blot - 75 kDa - 27 kDa 10 50 100 250 µM Homocysteine Caseinolytic serine protease 27 kDa - 1 2 3 4 5 (1) Absence d’inhibiteur (2) Inhibiteur des métalloprotéases (1,10 phenanthroline) (3) Inhibiteur des serine protéases (PMSF) (4) Inhibiteur des cystéine protéases (Iodoacetamide) (5) Inhibiteur des aspartate protéases (Pepstatine A). Human tissue Kallikrein (hK1) -Casein Zymography 27 kDa - 10 50 100 250 µM Homocysteine

29. métabolisme Problème métabolique Hyperhomocysteinemie Activation de systèmes protéolytiques - déséquilibre MMPs/TIMPs : MMP-2, MMP-9 - serine protease(s?) activatrice de MMPs remodelage Dégradation des structures élastiques artérielles Artériosclérose, athérosclérose clinique

30. Hyperhomocystéinémie Remodelage matriciel • Atteinte structures élastiques • artère, cristallin (?), peau (?) • Elastolyse vs défaut d’élastogenèse dans: • - hyperhomocysteinemies acquises • - hyperhomocysteinemies innées • défaut d’assemblage des fibres élastiques •  ↑ sensibilité à la dégradation protéolytique ? •  ↑ expression/activité des MMPs ? • Et les collagènes ? • os, artère, peau (?)

31. Laboratoirede Biochimie UMRs-608. Faculté de Pharmacie – Université de la Méditerranée. Marseille. Thierry Augier André Barlatier Alexandrine Bertaud Raymond Calaf Claire Cerini Corinne Chareyre Edouard Lamy Cécile Genovesio Philippe Charpiot LaboratoiredePhysiopathologie des Tissus non Minéralisés Faculté de Chirurgie Dentaire– Université René Descartes – Montrouge Gaston Godeau Sylvie Igondjo-Tchen Karim Senni