BIOSENSORE : definizione

1. BIOSENSORE : definizione TRASDUTTORE ELEMENTO BIOLOGICO Un biosensore può essere definito come un dispositivo analitico costituito da un sistemabiologico in grado di interagire in modo selettivo con l’analita di interesse in intimo contatto con un trasduttore che converte il processo dell’interazione in un segnale fisico. ANALITA TARGET SEGNALE MISURABILE Membrana selettiva

2. Requisiti di un biosensore • 1. Relevance of output signal to measurement environment • 2. Selectivity and repeatability • 3. Sensitivity and resolution • 4. Dynamic range • 5. Speed of response • 6. Insensitiveto temperature (or temperature compensation) • 7. Insensitive to electrical and other environmental interference • 8. Amenable to testing and calibration • 9. Reliability and Self-Checking Capability • 10. Physical robustness • 11. Service requirements and price • 12. Life time and Reusability

3. According to a recently proposed (1999) IUPAC definition: • “A biosensor is a self-contained integrated device which is capable of providing specific quantitative or semi-quantitative analytical information using a biological recognition element which is in direct spatial contact with a transducer element. • A biosensor should be clearly distinguished from a bioanalytical system, which requires additional processing steps, such as reagent addition. • Furthermore, a biosensor should be distinguished from a bioprobe which is either disposable after one measurement, i.e. single use, or unable to continuously monitor the analyte concentration”.

4. Biosensori: classificazione Sistemi biocatalitici: -Operano in un ambito di concentrazione mM-M -Si possono riutilizzare -Possono operare in continuo Sistemi di legame di affinità: -Operano in un ambito di concentrazione  M-pM -Monouso e difficilmente riutilizzabili

5. Elemento biologico di riconoscimento molecolare • Enzimi (biosensore catalitico) -transformazionedell’analitain un prodotto misurabile -inibizionedell’ enzimada parte dell’ analita • -modifichedell’enzimaindotte dall’analita • Antigene-anticorpo • -legame ad alta affinità con un tracciante che produce il • segnale o direttamente reazione Ab-Ag senza tracciante • DNA: • -reazioni di ibridazionead alta affinità • Sensori Biomimetici • - molecole ad alta affinità (singole catene di • anticorpi,..) • - polimeri imprintati • Biosensori cellulari -inibizione della vitalità cellulare(respirazione,.. • -proteineditransportodi membrana • -neurorecettori(producono il signaleattraverso i canali ionici • -cellule (batteri, lieviti,..) geneticamente modificati per esprimere • l’elemento di riconoscimento molecolare (recettore, proteina di • legame,..)e un gene reporter per la trasduzione in un segnale • misurabile (luc, lux, GFP,..)

6. BIOSENSORE : Trasduzione • Il segnale che viene prodotto dalla interazione dell’ analita con l’ elemento biologico può essere: • Potenziometrico modifiche nella distribuzione delle cariche che produce un potenziale elettrico • Amperometrico movimento di elettroni in una reazione redox • Calorimetrico produzione o assorbimento di calore dal processo chimico • Ottico assorbimento, emissione, rifrazione, “scattering” ..della luce nella reazione • Piezoelettrico variazioni di massa dovuti al legame dell’analita • Foto-acustico,..……

7. Principio dei biosensori RECOGNITION LAYER TRANSDUCER Analyte Electro-activesubstance pH Changes Heat Light Mass changes Electrode pH electrode Semiconductor Thermistor Photon counter Piezoelectric Dv Enzyme Antibody Micro-Organism Cell Electric signal

8. Per Riassumere:

9. Cenni storici del Biosensori • Concetto e principio -- Leland Clark (1956) • Sensore per l’ urea -- Guibault & Montalvo (1969) • Glucosio - Yellow Springs Instr. Co. (1973) • Termistore enzimatico – Mosbach (1974) • Electrodo a microorganismi – Divis (1975) • Sensore per l’ Ossigeno a fibra-ottica – Lubbers & Opitz (1975) • Immnosensore – Liedberg et al. (1982) • Elettrodo enzimatico – MediSense Inc. (1987) • BIAcore – Pharmacia, Sweden (1990) • Nanosensore – Vo-Dinh (2000)

10. Potenziali campi di applicazione • farmaci, residui,tossine,..negli alimenti • microinquinantinell’acqua e nell’aria • monitorare un processo biologico • virus, bacteria,.. • ions • composti organici • analiti di interesse chimico-clinico e diagnostico • …………… Sistemi complementari ai sistemi analitici tradizionali con l’obiettivo principale di ottenere una risposta rapida o in tempo reale

11. Biosensori Elettrochimici Potenziometrici :Viene misurato il potenziale di una cella a valore di corrente zero. Amperometrici:Si misura l’Intensità di correntedovuto ad un processo Ox-red.

12. Biosensori potenziometrici Potenziometria: tecnica nella quale si misura la differenza di potenziale tra due elettrodi ( elettrodo di riferimento e elettrodo indicatore) in condizioni di equilibrio Elettrodo di riferimento Risultato: Differenza di potenziale Processore di segnale I corrente = 0 Elettrodo indicatore

13. Elettrodi ionoselettivi ISE Elettrodo di riferimento (esterno) ISE (elettrodo indicatore) [ai]campione Membrana V Ecell = Eind – Eref + Elj semplificata: Ecell = K + Eind Equazione di Nernst Ecell = K + 2.3 RT log [ai]campione zF Curva Standard Ecell Dove: E = Potenziale elettrochimico K = costante R = Costante dei gas (8.314 joules/(mole)(°K)) T = Temp. assoluta Z = Numero di elettroni trasferiti F = Costante di Faraday (96,487 coulombs/mole di elettroni) ai = Attività della specie ionica (ai = Cifi; dove C è la concentrazione dello ione ed f ilcoefficiente di attività . log [ai]campione

14. Esempi di elettrodi ionoselettivi ISFET Elettrodo a vetro Risultato: variazione di potenziale Variazione di carica dovuta al legame di H+ alla membrana Elettrodo per il Sodio

15. Esempi di elettrodi ionoselettivi Elettrodo per il Potassio Elettrodo per la CO2 Valinomicina

16. Esempio di biosensore potenziometrico (a) Membrana semi-permeabile (b) Biocatalizzatore (c) Membrana di vetro (d) Probe per il pH (e) Potenziale elettrico generato (f) Elettrodointerno Ag/AgCl (g) HCl diluto (h) elettrodoesterno di riferimento

18. Vantaggi e svantaggi dei Biosensori Potenziometrici • Vantaggi • Disponibilità di un elevato numero di enzimi utilizzabili. • Elevata tecnologia disponibile e conoscenze scientifiche • Facile installazione, misure semplici e dirette . • Diverse configurazioni ( Statica, a flusso , micro ). • Facile automazione e applicabilità • Bassi costi. • Svantaggi • Scarsa selettività di alcuni biosensori. • Il numero di biosensori disponibili è molto limitato

19. Immagini di alcuni Biosensori ISFET

20. Biosensori amperometrici Una misura amperometrica consiste nel rilevare una corrente che passa tra due elettrodiai quali è stata applicata una differenza di potenziale che viene mantenuta costante. Elettrodo di riferimento Risultato: Intensità di corrente Processore di segnale Differenza di potenziale prefissata Elettrodo di lavoro

21. Elettrodo ad Ossigeno Il biosensore amperometrico più semplice utilizza l’elettrodo ad ossigeno di Clark. Questo è costituito da un catodo di Pt al quale l’O2 si riduce ed un elettrodo di riferimento Ag/AgCl. . Ag anodo 4Ag0 + 4Cl-4AgCl + 4e-  Pt catodo O2 + 4H+ + 4e-2H2O  Collegamento amplificatore introduzione elettrolita KCl 100 mM Filo di Ag ricoperto con AgCl Tubo di plexiglas Filo di Pt forgiato per essere sigillato da vetro ed avere una superficie piatta esposta all’analita Membrana permeabile all’O2

22. Biosensori amperometrici di I generazione I biosensori amperometrici di prima generazione monitorano il consumo di O2 o la produzione di H2O2 associate all’ossidazione di un substrato da parte di un enzima ossidasi

23. Biosensore amperometrico per il glucosio Membrana permeabile all’O2 glucosio La glucosio ossidasi catalizza la seguente reazionein due passaggi: Glucosio + FAD + H2O ———> Acido gluconico +FADH2 FADH2 + O2 ———> H2O2 + FAD La glucosio ossidasi è immobilizzata sulla membrana a gas del sensore così l’elettrododi lavoro compete con l’enzima per l’ossigeno molecolare. .

24. Biosensore amperometrico per il glucosio • Misure batch • Misure in flusso Tipica risposta del biosensore amperometrico per il glucosio

25. Biosensore amperometrico per il glucosio • Misure FIA (flow injectio analysis)

26. Biosensore ad acqua ossigenata La stessa reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi può essere utilizzata per monitorare la produzione di acqua ossigenata. Il sensore ad acqua ossigenata è in diretto contatto con la soluzione da misurare, la sua selettività è dovuta ad una membrana di acetato di cellulosa. L’acqua ossigenata è ossidata all’elettrodo di lavoro secondo la seguente reazione: H2O2 —-——> O2 + 2H+ + 2e- L’enzima è immobilizzato e tenuto il più vicino possibile l’elettrodo di lavoro. E’ prodotta una corrente proporzionale alla concentrazione del metabolita da analizzare. Un fattore limitante di questi sensori è che sono dipendenti dalla solubilità dell’ossigeno nelle soluzioni campione.

27. Biosensori amperometrici di II generazione • Si utilizzano dei “mediatori” che trasferiscono gli elettroni direttamente all’elettrodo bypassando la riduzione dell’ossigeno. • I ferroceni rappresentano il gruppo di mediatori più utilizzati .

28. Biosensori amperometrici di III generazione

29. Biosensori Amperometrici Vantaggi • Non influenzato dal drift dell’elettrodo di riferimento • Risposta lineare. • Sono più sensibili di quelli potenziometrici. E’ possibile miniaturizzarli Svantaggi • La corrente amperometrica consuma l’analita e la sua diffusione influenza la risposta. • La misura amperometrica viene eseguita ad un particolare potenziale di lavoro dove altre sostanze potrebbero reagire ed interferire. • Il materiale all’anodo si consuma riducendone il tempo di utilizzo, paricolarmente quando si utilizzano film sottili di Ag/AgCl .

30. Cristallo di quarzo Elettrodo d’oro Sensori Piezoelectrici Sistemi piezoelettrici Microbilancia al quarzo QCM

31. Microbilancia al quarzo (QCM) Modifiche nell’intorno del cristallo

32. Biosensori Piezoelettrici Transduttore: microbilancia cristallo di quarzo (QCM) probe immobilizato DNA Target, Ag, Ligando Si forma un duplex, Ab-Ab, Complesso lig-recettore la massaaumenta Cala la frequenza di risonanza del cristallo

33. Biosensori Piezoelettrici Analita in soluzione Cristallo di quarzo Oscillatore 10MHz La relazione tra massa m e frequenza f è data dalla nota relazione di Sauderbery: Dove: -Δf è la variazione di frequenza (Hz), -Δm è la variazione di massa della sostanza assorbita sulla superficie (g), - K è una costante che dipente dalla densità e dal tipo di cristallo (taglio), -A è la superficie (cm2)

34. Biosensori Piezoelettrici Sensitive coating elemento biospecifico immobilizzato

35. Tecniche di immobilizzazione 1)Immobilizzazione fisica: operativamente semplice ma meno stabile. 2)Immobilizzazione chimica: operativamente complessa, ma più stabile Schema di reticolazione con BSA-gluteraldeide Schema di reticolazione su membrane carbossiliche con carbodimmide

36. Immobilizzazione di una proteina Sviluppo di immunosensori L’obiettivo è quello di minimizzare interazioni aspecifiche e quindi sviluppare un immunosensore specifico e con il vantaggio di non utilizzare un tracciante e quindi misurare direttamente l’interazione Ab—Ag Si può utilizzare per esempio: sistema avidin-biotin, thiol-dextran, DSP, silanizzazione e assorbimento.

37. Superficie del sensore Processore Ligando Immobilizzato Rivelatore Ottico Segnale Elettrico Biosensore Ottico Riconoscimento molecolare Risultato

38. Biosensore Ottico: Principi

39. Biosensore Ottico: Principi

40. Biosensore a fluorescenza Es: biosensori basati su esteri del boro

41. Indirect Optical Immunosensors : FCFD Fluorescence Capillary Fill Device

42. Biosensore a fluorescenza Fiber-optic cholesterol sensor

43. Sistema ottico per misure intracellulari T. Vo-Dingh et al., Sensors and Actuators B, 2001

44. Sistemi ottici basati di misura della luce evanescente

45. Biosensori a risonanza di superficie plasmonica (SPR) SPR, fenomeno che avviene quando la luce è riflessa da un film sottile di un metallo

47. Biosensori a SPR: applicazioni

48. Biosensore ottico ad onda evanescente n1 > n2

49. Substrati analizzabili con biosensori enzimatici

50. Biosensore calorimetrico