Disciplina: Introdução à Biotecnologia

1. Disciplina: Introdução à Biotecnologia Aluna: Catarina Macedo de Figueirêdo Orientadora: Margarida Matos de Mendonça Estratégias Moleculares na Avaliação da Diversidade Microbiana em Amostras Ambientais

2. Diversidade Microbiana • 7 - 100 Milhões ⇨ estima-seser o número real de seres vivos; • 1,5 Milhões de organismos vivos ⇨ identificados. • Bactérias ⇨ 5 mil espécies ⇨ 100 mil a 1 milhão de espécies • Fungos ⇨ 100 mil espécies ⇨ 200 patogênicas aos seres vivos • Protozoários ⇨ 20 mil espécies ⇨ poucas são patogênicas. (TORTORA, et al., 2005)

3. Ampla Microbiota Solo Rizósféricos Águas Residuais Sistemas de Lodo Ativado Baixa Microbiota Ar Ambientes Marinhos Águas Doces Solo Ambientes da Diversidade Microbiana

4. CULTURA PURA CULTURABILIDADE NOVAS TÉCNICAS DE CULTIVO TÉCNICAS MOLECULARES Avaliação da Diversidade Microbiana • Diversidade Microbiana ⇨ fracamente conhecida ⇒ culturabilidade. www.bdt.fat.org.br

5. Dependente de Cultivo Independente de Cultivo Estratégias de Detecção - Detecção - Identificação - Quantificação • Técnicas

6. Técnicas dependentes de cultivo • Culturas Puras • Isolamento • Cultivo • Identificação • Falha na detecção de microrganismos. • Complexa formulação dos meios de cultura. • Técnicas clássicas: bioquímica e microbiologia ➭ baixa determinação da biomassa e da estrutura. • Falsa representação da diversidade microbiana em amostras ambientais. • Tempo. (HURST, et al., 1997)

7. Técnicas independentes de cultivo • Descrição da diversidade microbiana; • Definição da estrutura e dinâmica de comunidades complexas; • Técnicas moleculares; • Desenvolvimento de novos métodos moleculares de identificação de microrganismos não cultiváveis. (WALNER, et al., 1997; LEE, et al., 1999; NILSEN, et al., 1999; FOSTER, et al., 2003)

8. Águas Residuais • Esgoto: “ Líquido caracterizado pelos despejos provenientes das diversas modalidades de uso e de origem das águas, tais como as de uso doméstico, comercial, industrial, utilidade pública, de áreas agrícolas, de superfície, de infiltrações, pluviais e de outros efluentes sanitários.” (JORDÃO & PESSOA, 1995)

9. Domésticos – Despejos domésticos, pluviais, infiltrações e pequenas parcelas industriais • Esgotos • Industriais – provêm de qualquer utilização da água para fins industriais. • Características do Esgoto • Matéria sólida • Odor • Cor e turbidez - Físicas (JORDÃO & PESSOA, 1995)

10. Matéria Orgânica: proteínas, carboidratos, gorduras e óleos, uréia, surfactantes, fenóis, pesticidas • Matéria inorgânica: areia, substâncias minerais dissolvidas. - Químicas • Bactérias • Fungos • Vírus • Algas • Protozoários - Microbiológicas (JORDÃO & PESSOA, 1995)

11. Tratamento de Esgoto • Objetivo: “ Separar a água dos componentes sólidos, com a intenção de purificar a água, tornando-a livre de patógenos e poluentes, podendo ser liberada ao meio ambiente.” (HURST, et al., 1997) • Etapas: • Processo físico • Processo químico • Processo biológico (JORDÃO & PESSOA, 1995)

12. Tratamento Primário Tratamento Secundário Tratamento Terciário Processo Físico Processo Biológico Processo Químico Tratamento de Esgoto

13. Tratamento de Esgoto • Processo biológico • Oxidação do lodo (aeróbia) • Digestão do lodo (anaeróbia) • Lodo ativado É uma fase essencialmente biológica no sistema de tratamento de esgoto doméstico e industrial, realizada aerobicamente. “ O lodo ativado é composto por materiais sedimentados provenientes das seqüências de águas residuais e de sólidos gerados pelo processo de tratamento de esgoto” (DAVIS & CORNWELL, 1998)

14. Lodo Ativado Forma livre • Microrganismos Agregada - flocos - Agitação - Suplemento de O2 - Dispersão microbiana Aeração • Biomassa floculada • Sólidos ⇨ retornam ao compartimento aeróbico Sedimentação

19. Lodo Ativado Compostos orgânicos Multiplicação Crescimento celular [ O2 ] Produção de energia Compostosinorgânicos Produção de CO2, NO3, O2, SO4,PO 4, H2O.

20. Lodo Ativado • Características Físico-Químicas: Matéria orgânica, nutrientes, metais pesados, compostos inorgânicos potencialmente tóxicos. • Finalização inadequada do tratamento: Riscos à saúde, acúmulo de metais pesados ou compostos orgânicos no solo ou no efluente. • Microbiologia do Lodo Ativado (GONÇALVES, et al., 1999) • Diversidade microbiana • Dinâmica das populações • Predomínio bacteriano (GRAY, 1990)

21. Lodo Ativado • Bactérias • Dispersas na fase líquida • Associadas ao floco e participando de sua estrutura • Associadas ao floco, mas não participando da sua formação • Bactérias do afluente ≠ bactérias do lodo • pH • Temperatura • O2 • Nutrientes • Agitação • Carga afluente • Idade. • Fatores (HURST, et al., 1999; GRAY, 1990)

22. Lodo Ativado • Gêneros envolvidos no consumo da matéria orgânica (GRAY, 1990)

23. Desnitrificantes Uréia ⇨ NH4⇨ NO3 NO3 ⇨ N2 Lodo Ativado • Nitrificantes (GRAY, 1990)

24. Lodo Ativado • Fungos • Pequena incidência; • Estão associados à estrutura do floco • Associado a Idade • pH < 6,0 ⇨ dominânciafúngica • Protozoários • Componentecomum; • Gênerosresistentes⇨ Giardia e Cryptosporidium

25. Lodo Ativado • Vírus • Organismos aquáticos ou patógenos ao homem. • Grupos Presentes: Enterovirus Orthoreovirus Rotavirus Mastaadenovirus • Bacteriófagos ⇨ material fecal Doenças entéricas

26. Identificação da microbiota Determinação da diversidade Técnica independente de cultivo (DAHLLOF, 2002) Técnicas Moleculares Utilizadas na Identificação Microbiana no Lodo Ativado • Métodos Tradicionais Isolamento; Identificação: morfologia e bioquímica. (LIU, et al., 2005) • Métodos Moleculares: Estudo das sequências de rRNA.

27. CULTURA AMOSTRAS FISH PCR in situ HIBRIDIZAÇÃO MICROARRANJOS EXTRAÇÃO PCR DGGE, TGGE CLONAGEM SEQÜÊNCIAMENTO (DAHLLOF, 2002)

28. Hibridização in situ e FISH • Metodologia • Hibridização de uma seqüência alvo de DNA ou de RNA com uma sonda de oligonucleotídeos marcada quimicamente ou radioativamente. • Sondas ➭ Específicas ➭ Identificação dos microrganismos. FISH • Técnica Molecular ➭ Independente de cultivo • Possibilidade de identificação da diversidade microbiana, sem alteração da sua estrutura espacial. (COOPER, 2002; ALBERTS, et al., 2006)

31. FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado • Inúmeros trabalhos relatam a utilização da técnica de FISH na avaliação da diversidade microbiana nos sistemas de Lodo Ativado.

32. FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado Chen et al., 2003 Análise de seqüências específicas de 16S rRNA Estudo as alterações na prevalência de organismos de acordo com a concentração de cloro: • Concentração de Cl-⇒ 10 - 30 mg/L • Oxidantes de NH4 ⇒ Predominância de Nitrossomonas • Oxidantes de NO2 ⇒ Nitrobacter • Redução do floco ⇒ ↑ da [ Cl-] • Até 10 mg/L ⇒ mesma predominância ⇒↑ 10 mg/L diferentes espécies de Nitrossomonas • Nitrobacter ⇒ Predominância contínua.

33. Fonte: CHEN, et al., 2003

34. Fonte: Chen et al., 2003

35. FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado Liu et al., 2005 Análise de seqüências específicas das subunidades 16S do rRNA. Estudo para identificação das EBPR (bactérias removedoras de P). • Análise do PPs intracelulares (PAOs) ⇒ DAPI • Sondas: EUB 338, GAM 42ª, ACA 23 • Protebacteria ⇒ Prevalência de 70 %⇒ -Proteobacteria ⇒ 60 % • Gênero Acinetobacter ⇒ 31 % ⇒ Não caracterizada como PAO (organismo acumulador de polifosfatos) • PAOs não foram caracterizados ⇒ sequênciamento ⇒ pequena similaridade com Banco de Genes.

37. FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado Wonget al., 2005 Hibridização de seqüências – alvo de rRNA com sondas fluorescência (FISH) Estudo para identificação de EBPRs⇒ PAOs, GBs • Sondas: EUB mix, PAO mix, actino_1011 • EUB mix ⇒ 9 % de PAOs • Rhodocyclus⇒ β- Proteobacteria predominância dentre as PAOs ⇒ 10-30% das Eubacteria • Tretrasphera ⇒ Actinobacteria ⇒ actino_1011 ⇒ 7-10%; • β- Proteobacteria apresentaram-se predominantes com 25% • 30-60% da população ⇒ EBPRs

39. Conclusões Vantagens da Utilização da Técnica de FISH: • FISH possibilita a avaliação da diversidade microbiana sem a necessidade de cultivo; • Possibilita a quantificação e determinação da estrutura da comunidade microbiana; • Permite a detecção das alterações da prevalência microbiana nas comunidades estudadas; • Diversas metodologias que podem ser específicas às células a serem hibridizadas; • Técnicas de metodologias relativamente rápidas e de fácil execução, em relação às técnicas dependentes de cultivo.

40. Desvantagens da utilização da Técnica de FISH: Identificação de microrganismos específicos; Na determinação da microbiota de uma comunidade ⇨ utilização de muitas sondas diferentes; Custo relativamente alto; Sobreposição das sondas hibridizadas ⇨ Alteração das cores emitidas pelas sondas ⇨ dificuldade na identificação do microrganismo; Metodologias dependentes da permeabilidade dos microrganismos em relação a entrada das sondas.