Informe sobre el equipo y técnica de electroforesis

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL INGENIERIA AMBIENTAL INFORME SOBRE LA MAQUETA EQUIPO Y TÉCNICA DE ELECTRO EQUIPO Y TÉCNICA DE ELECTROFORESIS DE ADN FORESIS DE ADN Estudiante: Jovarina Ccallo Ginez Asignatura: Biotecnología CICLO: VII Docente: Dr. Hebert H. Soto Gonzales 2020 1

2. INDICE INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 5 ANTECEDENTES ...................................................................................................... 6 FUNDAMENTO TEÓRICO ......................................................................................... 7 1. Electroforesis ................................................................................................... 7 1.1. Electroforesis de ácidos nucleicos .......................................................... 8 1.2. Electroforesis de proteínas ..................................................................... 9 2. Como se realiza la electroforesis en gel .......................................................... 9 2.1. Preparación del gel ................................................................................. 9 2.2. Preparación del ADN para electroforesis.............................................. 10 2.3. Separación de los fragmentos .............................................................. 11 2.4. Visualización de los resultados ............................................................. 11 3. Aplicaciones de la electroforesis ................................................................... 12 a. Enfermedades.......................................................................................... 12 b. Parentesco humano ................................................................................. 12 c. Vida animal .............................................................................................. 13 d. Criminología ............................................................................................. 13 MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 14 1. Materiales ...................................................................................................... 14 2. Metodología ................................................................................................... 15 2.1. Equipo .................................................................................................. 15 a. Elaboración del molde .......................................................................... 15 b. Elaboración de la bandeja .................................................................... 16 c. Elaboración del peine ........................................................................... 17 d. Elaboración de la fuente de alimentación ............................................. 17 e. Elaboración de la cubeta o cámara de electroforesis ........................... 19 2

3. 2.2. Técnica ................................................................................................. 23 CONCLUSIONES..................................................................................................... 27 REFERENCIAS ........................................................................................................ 27 INDICE DE ILUSTRACIONES Ilustración 1: Electroforesis de ADN. .......................................................................... 7 Ilustración 2: Materiales utilizados para la maqueta. ................................................ 14 Ilustración 3: Material vidrio para la cámara de electroforesis. ................................. 14 Ilustración 4: Para el molde (Material cartón). .......................................................... 15 Ilustración 5: Pintado del molde. .............................................................................. 15 Ilustración 6: Molde. ................................................................................................. 15 Ilustración 7. Marcado de los rectángulos para la elaboración de la bandeja. (Material plástico). ................................................................................................................... 16 Ilustración 8: Corte del vidrio para el soporte de la bandeja. .................................... 16 Ilustración 9: Bandeja. .............................................................................................. 16 Ilustración 10: Recorte de los palitos de la paleta para el peine. ............................. 17 Ilustración 11: Peine. ................................................................................................ 17 Ilustración 12: Moldes para realizar la fuente de alimentación (Material cartón). ..... 18 Ilustración 13: Recortes (del cartón de papel higiénico) para el enchufe. ................ 18 Ilustración 14: Para el enchufe. ................................................................................ 18 Ilustración 15: Pintado (pintura Apu) la fuente de alimentación. .............................. 18 Ilustración 16: Uniendo los moldes. ......................................................................... 18 Ilustración 17: Cables. .............................................................................................. 18 Ilustración 18: Material para los cables. ................................................................... 18 Ilustración 19: Fuente de alimentación. .................................................................... 19 Ilustración 20: Armado de la cámara de electroforesis............................................. 19 Ilustración 21 ............................................................................................................ 20 Ilustración 22: Recorte (Material plástico) para el campo de los electrodos. ............ 20 Ilustración 23 ............................................................................................................ 20 3

4. Ilustración 24: Recorte del material para los lados laterales de la cámara de electroforesis. ........................................................................................................... 21 Ilustración 25: Pegando del campo de electrodos. ................................................... 21 Ilustración 26: Cámara de electroforesis. ................................................................. 21 Ilustración 27: Electroforesis horizontal del ADN ..................................................... 22 Ilustración 28: Preparación de la bandeja, el molde y el peine. ............................... 23 Ilustración 29: Gel de agarosa en la bandeja. .......................................................... 23 Ilustración 30: Ejemplo ............................................................................................. 23 Ilustración 31: Retirando la bandeja del molde. ....................................................... 24 Ilustración 32: La bandeja con el gel en la cámara o cubeta de la electroforesis. .... 24 Ilustración 33: Llenado de buffer en la cubeta. ......................................................... 24 Ilustración 34: Ejemplo. ............................................................................................ 25 Ilustración 35: Muestras en los pocillos. ................................................................... 25 Ilustración 36: Ejemplo. ............................................................................................ 25 Ilustración 37: Tapar la cubeta. ................................................................................ 26 Ilustración 38: Conectar a la fuente de alimentación ................................................ 26 4

5. INTRODUCCIÓN El presente trabajo es sobre la elaboración de la maqueta de equipo y técnica de electroforesis de ADN y su fundamento científico. Pues es importante conocer de este tipo de equipos, saber para qué son y para qué son utilizados. La electroforesis en si es una técnica usada para separar las moléculas cargadas como el ADN, según su tamaño. Donde las moléculas cargadas se mueven a través de un gel cuando pasa una corriente eléctrica a través de él. Se aplica una corriente eléctrica a través del gel para que un extremo del gel tenga una carga positiva y el otro extremo tenga una carga negativa. El movimiento de moléculas cargadas se llama migración. Las moléculas migran hacia la carga opuesta. Por tanto, una molécula con carga negativa será arrastrada hacia el extremo positivo. Entonces, la electroforesis permite distinguir fragmentos de ADN de longitudes. El ADN está cargado negativamente, por lo tanto, cuando se aplica una corriente eléctrica al gel, el ADN migrará hacia el electrodo cargado positivamente. Por lo consiguiente en este informe se explicará sobre los antecedentes de la electroforesis, fundamento teórico, la metodología para la elaboración de la maqueta del equipo y técnica de la electroforesis y finalmente las conclusiones. 5

6. ANTECEDENTES Las primeras biomacromoléculas en estudiarse fueron las proteínas. En este contexto fue que se diseñó una técnica que permitiera separar de forma controlada a las proteínas, por lo que el primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por Tiselius en 1937. Su trabajo le valió el premio Nóbel en 1948. Fue Tiselius quien desarrolló el concepto de frente móvil (moving boundary), que más tarde se conoció como electroforesis de zona y se usó para separar proteínas en solución. La extensión del trabajo de Griffith por Oswald Avery y sus colaboradores demostró que el "principio transformante" era el ácido desoxirribonucleico (ADN). Esto colocó al ADN en el centro del entendimiento más íntimo de la célula: la naturaleza de las instrucciones que dictan su funcionamiento. De forma natural, la técnica primordial de la electroforesis fue adaptada al análisis del ADN (Thorne, 1966). Entre 1940 y 1960 sobrevino un desarrollo de la electroforesis, aplicándose a diversas moléculas, desde proteínas grandes hasta aminoácidos y iones inorgánicos. A la electroforesis de zona se sumaron además el isoeletroenfoque y la isotacoforesis, basadas en diferentes propiedades físicas. Esto permitió realizar análisis separados en una misma muestra o bien combinaciones de métodos. La distinción entre los tres métodos también se da a nivel de las matrices empleadas en cada una, que brindan ventajas comparativas dependiendo de la técnica y de la muestra a separar. Así, se han usado geles de polímeros, papel y capilares. El papel es fácil de usad dado que no es necesaria una preparación previa, pero con el tiempo se han privilegiado el uso de matrices tipo gel. Smithies en 1955 introdujo el uso de geles de almidón, y dos años más tarde Kohn usó acetato de celulosa. En 1959 Omstein y Davis y Raymond y Veintraub usan un gel de poliacrilamida. Los capilares fueron introducidos por Jorgenson y Lukacs a principios de los 80. Las técnicas de detección han evolucionado con los años también. Algunas de estas técnicas incluyen el teñido quimico, técnicas inmunoelectroforéticas, análisis bidimensional y varias técnicas de inmovilización en membranas. Hoy la electroforesis se aplica principalmente al análisis de muestras biológicas. Es ampliamente usada en análisis de DNA para química forense y en la investigación biológica. 6

7. FUNDAMENTO TEÓRICO 1. Electroforesis La electroforesis de ADN es una técnica fundamental en la biología molecular que permite la separación de moléculas de ADN de hasta ~50 Kbp. (Lagos- Susaeta et al., 2020). La electroforesis es un método de separación basado en la movilidad de las biomoléculas en una fase líquida sometida a un campo eléctrico. Las moléculas que posean carga negativa migrarán hacia el polo positivo de un aparato electroforético y viceversa. La inclusión de una matriz sólida, además de la fase líquida, permitió agregar un nuevo punto de separación y versatilidad en la electroforesis (Smithies, 1955). De esta manera, no solo las biomoléculas pueden ser separadas por su carga, sino también por su tamaño. La inclusión de una matriz permite algo que invariablemente sorprende a los estudiantes de biología molecular: recuperar físicamente a la biomolécula que ha sido separada en un gel, con la ayuda de una navaja y un agente de visualización. (Peña-Castro et al., 2013) Ilustración 1: Electroforesis de ADN. 7

8. 1.1. Electroforesis de ácidos nucleicos La aplicación de la electroforesis en la separación de ácidos nucleicos permite hacer tareas simples, como verificar su síntesis o integridad, y complejas, como seguir los pasos enzimáticos de modificación durante la construcción de elaboradas colecciones de ADN. Su fundamento químico reside en que los ácidos nucleicos son polímeros de carga negativa unidos por enlaces covalentes fosfodiéster. De esta manera, el ADN y el ARN se moverán en un campo electroforético hacia el polo positivo.(Peña-Castro et al., 2013) La matriz sólida preferida para separar los ácidos nucleicos es la agarosa pues da una capacidad de separación adecuada para la mayoría de las actividades rutinarias. Además, puede ser flexibilizada con la concentración utilizada. La electroforesis en agarosa es accesible debido a su bajo costo, a la diversidad de diseños de cámaras, y a que es fácil de preparar (Brody y Kern, 2004). El uso de acrilamida como matriz sólida, en lugar de la agarosa, aumenta la resolución a la escala de pares de bases y se aplica en el monitoreo de los pequeños ARNs, la separación de moléculas durante la secuenciación y en la separación de moléculas de pesos moleculares similares pero diferente composición de nucleótidos en gradientes desnaturalizantes (Stellwagen, 2009; Barrera-figueroa et al., 2011). El ARN necesita un agente desnaturalizante en la matriz debido a que al ser de cadena sencilla puede hibridarse consigo mismo modificando su tamaño molecular aparente. Frecuentemente se usa formaldehído o urea como agente desnaturalizante para romper los puentes de hidrógeno intramoleculares. Por otra parte, la visualización de los ácidos nucleicos en la electroforesis necesita de un agente. Estos son generalmente compuestos químicos de estructura plana que se intercalan entre los enlaces de hidrógeno de los ácidos nucleicos, por ejemplo, bromuro de etidio o SYBR green. Cuando estas moléculas se excitan con luz ultravioleta emiten fluorescencia que indica la posición de los ácidos nucleicos, la cual está en función de su tamaño molecular (Vitzthum, 2004) 8

9. 1.2. Electroforesis de proteínas Las proteínas son biomoléculas cuyos monómeros son aminoácidos polimerizados por medio de enlaces peptídicos. A diferencia de los ácidos nucleicos, que poseen una carga neta negativa, la carga de las proteínas es muy variable porque en ellas puede haber aminoácidos tanto negativos como positivos. De esta manera, las primeras separaciones electroforéticas proteicas eran toscas y necesitaban un gradiente de pH que las atrapará en su punto isoeléctrico (punto donde la proteína tendrá una carga neta de cero y no se podrá mover más en un campo eléctrico) (Tiselius, 1937). Laemmli (1970) implementó un tratamiento para poder separar a las proteínas con base en su peso molecular. Este consiste en la homogenización de la carga con dodecilsulfato de sodio (SDS), un detergente que simultáneamente desnaturaliza a las proteínas y las cubre de una carga neta negativa para que migren hacia el polo positivo durante la electroforesis. Este método se conoce como SDS–PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis). SDS–PAGE o electroforesis 1D (de una dimensión) es útil para las aplicaciones rutinarias como el seguimiento de los niveles de acumulación de proteínas, así como para su purificación, separación, hibridación con anticuerpos y análisis de peso molecular. (Peña-Castro et al., 2013). 2. Como se realiza la electroforesis en gel 2.1. Preparación del gel • Geles de agarosa se utilizan normalmente para visualizar fragmentos de ADN. La concentración de agarosa utilizada para hacer el gel depende del tamaño de los fragmentos de ADN con los que esté trabajando. 9

10. • Cuanto mayor sea la concentración de agarosa, más densa será la matriz y viceversa. Los fragmentos más pequeños de ADN se separan en concentraciones más altas de agarosa, mientras que las moléculas más grandes requieren una concentración más baja de agarosa. • Para hacer un gel, el polvo de agarosa se mezcla con un tampón de electroforesis y se calienta a una temperatura alta hasta que todo el polvo de agarosa se haya derretido. • Luego, el gel fundido se vierte en una bandeja de fundición de gel y se coloca un "peine" en un extremo para hacer pocillos en los que se pipeteará la muestra. • Una vez que el gel se haya enfriado y solidificado (ahora será opaco en lugar de transparente), se retira el peine. • Mucha gente ahora usa geles prefabricados. • A continuación, se coloca el gel en un tanque de electroforesis y se vierte tampón de electroforesis en el tanque hasta que se cubre la superficie del gel. El búfer conduce la corriente eléctrica. El tipo de tampón utilizado depende del tamaño aproximado de los fragmentos de ADN en la muestra. 2.2. Preparación del ADN para electroforesis • Se agrega un tinte a la muestra de ADN antes de la electroforesis para aumentar la viscosidad de la muestra, lo que evitará que flote fuera de los pocillos y se pueda ver la migración de la muestra a través del gel. • Se carga un marcador de ADN (también conocido como estándar de tamaño o escalera de ADN) en el primer pocillo del gel. Los fragmentos en el marcador son de una longitud conocida, por lo que pueden usarse para ayudar a aproximar el tamaño de los fragmentos en las muestras. • Las muestras de ADN preparadas se pipetean luego en los pocillos restantes del gel. 10

11. • Una vez hecho esto, se coloca la tapa en el tanque de electroforesis asegurándose de que la orientación del gel y los electrodos positivo y negativo sea correcta (queremos que el ADN migre a través del gel hacia el extremo positivo). 2.3. Separación de los fragmentos • Luego, se enciende la corriente eléctrica para que el ADN cargado negativamente se mueva a través del gel hacia el lado positivo del gel. • Las longitudes más cortas de ADN se mueven más rápido que las longitudes más largas, por lo que avanzan más en el tiempo que se ejecuta la corriente. • La distancia que ha migrado el ADN en el gel se puede juzgar visualmente controlando la migración del tinte tampón de carga. • La corriente eléctrica se deja encendida el tiempo suficiente para garantizar que los fragmentos de ADN se muevan lo suficiente a través del gel para separarlos, pero no tanto como para que se escurran por el extremo del gel. 2.4. Visualización de los resultados • Una vez que el ADN ha migrado lo suficiente a través del gel, la corriente eléctrica se apaga y el gel se retira del tanque de electroforesis. • Para visualizar el ADN, el gel se tiñe con un tinte fluorescente que se une al ADN y se coloca en un transiluminador ultravioleta que mostrará el ADN teñido como bandas brillantes. • Alternativamente, el tinte se puede mezclar con el gel antes de verterlo. • Si el gel se ha ejecutado correctamente, el patrón de bandas del marcador de ADN / estándar de tamaño será visible. 11

12. • Entonces es posible juzgar el tamaño del ADN en su muestra imaginando una línea horizontal que atraviesa las bandas del marcador de ADN. Luego, puede estimar el tamaño del ADN en la muestra comparándolos con la banda más cercana en el marcador. 3. Aplicaciones de la electroforesis La electroforesis en gel permite a los científicos separar las hebras de ADN, permitiendo así facilitar la identificación y examinación de sus componentes. A medida que el ADN se mueve a través del gel, ayuda a separar las secciones mayores y menores entre sí. Este proceso ofrece varias aplicaciones beneficiosas para proporcionar la información genética. Las principales aplicaciones que nos ofrece la electroforesis en gel nos sirven para: a. Enfermedades La electroforesis en gel puede ayudar a los científicos a identificar genes dañados, incluyendo los oncogenes. Puede ayudar también a identificar ciertas enfermedades genéticas como, por ejemplo, la anemia de células falciformes, la enfermedad de Huntington y la distrofia muscular de Duchenne, según lo explica la Universidad Estatal de Nueva York. También puede ayudar a identificar virus. b. Parentesco humano La electroforesis en gel puede determinar paternidad, así como establecer vínculos genéticos entre grandes grupos de personas, según lo explica la Universidad de Colorado. 12

13. c. Vida animal La electroforesis en gel ofrece muchos beneficios en campos relacionados con los animales. Los zoológicos pueden utilizar esta técnica para reducir el impacto negativo de la endogamia. Los taxónomos y biólogos evolutivos pueden obtener más información acerca de las relaciones evolutivas, identificar especies y documentar las diferencias entre ellos. Los que estudian el comportamiento animal pueden usar el ADN para obtener información sobre el parentesco de los animales y cómo ésto afecta a la interacción con otros animales. d. Criminología Los científicos también pueden utilizar este procedimiento para examinar muestras de tejido que se encuentran en escenas del crimen. 13

14. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Materiales Materiales Herramientas • Cartón • Culer • Palitos de paleta • Tijera • Retazos de vidrios • Cuchillo • Lana • Regla • Restos de residuo plástico • Pistola de silicona Ilustración 2: Materiales utilizados para la maqueta. Ilustración 3: Material vidrio para la cámara de electroforesis. 14

15. 2. Metodología 2.1. Equipo Como el equipo de electroforesis horizontal tiene muchos componentes para su posterior uso. El trabajo a realizar fue dividido en partes. a. Elaboración del molde Para elaborar el molde se utilizó el cartón, se midió un rectángulo de 10 * 13 cm para el soporte, 2 rectángulos de 2*10 cm y otros dos de 2*7 cm como muro, los cuales son unidos al soporte y finalmente pintados con la pintura Apu. Ilustración 4: Para el molde (Material cartón). Ilustración 5: Pintado del molde. Ilustración 6: Molde. 15

16. b. Elaboración de la bandeja Para elaborar la bandeja se utilizó el material vidrio y un tipo de plástico, se procedió a medir una forma de un rectángulo de 7 *10 cm para la base y otros dos de 1.5 * 10 cm. Finalmente fueron unidos. Ilustración 7. Marcado de los rectángulos para la elaboración de la bandeja. plástico). (Material Ilustración 8: Corte del vidrio para el soporte bandeja. de la Ilustración 9: Bandeja. 16

17. c. Elaboración del peine Para el peine su utilizó los palitos de las paletas o helados. Fue un paso sencillo. Ilustración 10: Recorte de los palitos de la paleta para el peine. Ilustración 11: Peine. d. Elaboración de la fuente de alimentación Para la fuente de alimentación o eléctrica se usó como material cartón. Se midió 2 rectángulos de 7*20 cm para los lados laterales, uno de 17*12 cm para la parte posterior, dos de 12*7 para la parte de atrás y adelante, y uno de 2.5 * 12 cm, todos los moldes fueron unidos y pintados con pintura Apu. Para los cables se utilizó el material tipo lana y cartón de papel higiénico. 17

18. Ilustración 12: Moldes para realizar la fuente de alimentación cartón). (Material Ilustración 16: Uniendo los moldes. Ilustración 15: Pintado (pintura Apu) la fuente de alimentación. Ilustración 14: Para el enchufe. Ilustración 13: Recortes (del cartón de papel higiénico) para el enchufe. Ilustración 18: Material para los cables. Ilustración 17: Cables. 18

19. Ilustración 19: Fuente de alimentación. e. Elaboración de la cubeta o cámara de electroforesis Para la elaboración de la cámara de electroforesis se utilizó como material el vidrio. Para ello se hicieron varios moldes y finalmente unidos. Ilustración 20: Armado de la cámara de electroforesis. 19

20. Ilustración 21 Ilustración 22: Recorte (Material plástico) para el campo de los electrodos. Ilustración 23 20

21. Ilustración 25: Pegando del campo de electrodos. Ilustración 24: Recorte del material para los lados laterales de la cámara de electroforesis. Ilustración 26: Cámara de electroforesis. 21

22. Electrodo (-) Fuente de Cubeta o cámara alimentación de electroforesis Electrodo (+) Molde Bandeja Peine Ilustración 27: Electroforesis horizontal del ADN 22

23. 2.2. Técnica La electroforesis es una técnica para separar moléculas cargadas, como el ADN, según su tamaño. Por lo que a continuación se ejemplificará paso a paso. 1° es necesario preparar la bandeja, el molde y el peine. Ilustración 28: Preparación de la bandeja, el molde y el peine. 2° se hecha el gel de agarosa a la bandeja y se deja enfriar y solidificar. Ilustración agarosa en la bandeja. 29: Gel de Gel de agarosa Ilustración 30: Ejemplo Fuente: Youtube: Quercuslab. 23

24. 3° Retirar el peine y pasar la bandeja con el gel de la agarosa a la cubeta o cámara de electroforesis. Ilustración 31: Retirando la bandeja del molde. Ilustración 32: La bandeja con el gel en la cámara o cubeta de la electroforesis. 4° Llenar la cubeta con buffer de electroforesis. Buffer Ilustración 33: Llenado de buffer en la cubeta. 24

25. Ilustración 34: Ejemplo. FuenteI: Youtube: Quercuslab. 5° cargar las muestras (pueden ser colorantes para un experimento) en los pocillos hechos en la bandeja con el gel. Ilustración 35: Muestras en los pocillos. Ilustración 36: Ejemplo. 25

26. 6° Cubrir la cubeta y conectarlo con la fuente de alimentación para programar el voltaje y de esa manera empieza la electroforesis. Y de esa manera se observa el movimiento de las moléculas con apoyo de un transiluminador. Ilustración 37: Tapar la cubeta. Ilustración 38: Conectar a la fuente de alimentación 26

27. CONCLUSIONES La elaboración del prototipo o maqueta fue muy interesante y fundamental para la mejor comprensión acerca del equipo y técnica de la electroforesis de ADN. REFERENCIAS Barrera-figueroa, B. E., Gao, L., Diop, N. N., Wu, Z., Ehlers, J. D., Roberts, P. A., Close, T. J., Zhu, J., & Liu, R. (2011). Identification and comparative analysis of drought-associated microRNAs in two cowpea genotypes. Lagos-Susaeta, D., Salazar, O., & Asenjo, J. A. (2020). openPFGE: An open source and low cost pulsed-field gel electrophoresis equipment. HardwareX, 8, e00128. https://doi.org/10.1016/j.ohx.2020.e00128 Peña-Castro, J. M., Gregorio-Ramírez, O., & Barrera-Figueroa, B. E. (2013). Los métodos experimentales que permiten el estudio de las macromoléculas de la vida: historia, fundamentos y perspectivas. Educación Química, 24(2), 237–246. https://doi.org/10.1016/s0187-893x(13)72468-6 Stellwagen, N. C. (2009). Electrophoresis of DNA in agarose gels, polyacrylamide gels and in free solution. ELECTROPHORESIS, 30(S1), S188–S195. https://doi.org/10.1002/elps.200900052 Vitzthum, F. (2004). Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I , its structure determination and methodological implications. 32(12). https://doi.org/10.1093/nar/gnh101 https://www.yourgenome.org/facts/what-is-gel- electrophoresis#:~:text=Gel%20electrophoresis%20and%20DNA,towards%20th e%20positively%20charged%20electrode.&text=They%20will%20appear%20as %20bands%20on%20the%20gel. https://www.equiposylaboratorio.com/portal/articulo-ampliado/cuales-son-las- aplicaciones-prActicas-de-la-electroforesis-en-gell 27