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Equilibrio Ossigenato/Ossidato

Il Laboratorio del CSOx Moderno ausilio per la diagnosi ed il monitoraggio clinico Andrea Bolner Villa Margherita, 27 settembre 2014. BAD. GOOD. Equilibrio Ossigenato/Ossidato. Ossigeno: indispensabile per la vita, condiziona i viventi che devono adattarsi a uno stato pro-ossidante. ROS.

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Equilibrio Ossigenato/Ossidato

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Presentation Transcript

  1. Il Laboratorio del CSOxModerno ausilio per la diagnosi ed il monitoraggio clinicoAndrea BolnerVilla Margherita, 27 settembre 2014

  2. BAD GOOD Equilibrio Ossigenato/Ossidato Ossigeno: indispensabile per la vita, condiziona i viventi che devono adattarsi a uno stato pro-ossidante

  3. ROS

  4. Gli ossidanti • Radicali liberi: instabili, altamente reattivi, ad emivita bassissima (10-5-10-9 sec), responsabili del danno ossidativo a carico di macromolecole biologiche (DNA, lipidi, carboidrati, proteine) • ROS = specie reattive dell’ossigeno • RNS = specie reattive dell’azoto • RGS = specie reattive glucosio-derivate • Pro-ossidanti non radicalici: • H2O2 • IDROPEROSSIDI

  5. Principali radicali liberi

  6. Stress ossidativo: ruolo fisiologicoPrincipali sorgenti dei ROS • Enzimi di membrana NADPH dipendenti (Nox 1-5 e Duox 1-2) • Mitocondri • Enzimi intracellulari: xantina ossidasi, cicloossigenasi, lipossigenasi

  7. Reazione di OSSIDAZIONE Reazione di RIDUZIONE Radicali liberiLA REAZIONE REDOX (1) Per ogni specie che si OSSIDA c’è un’altra specie che si RIDUCE Le specie che si RIDUCONO sono OSSIDANTI Le specie che si ossidano sono RIDUCENTI O ANTIOSSIDANTI

  8. BARRIERA ANTIOSSIDANTE ? SPECIE OSSIDANTI Il ruolo cruciale del LAB1+2 = 3ossidanti + antiossidanti = effetti 2 3 1

  9. AZIONI DEGLI OSSIDANTI Uno stress ossidativo è causa di ALTERAZIONI MOLECOLARI • fosfolipidi di membrana • modificazioni delle membrane • capacità di compartimentazione • capacità di trasporto selettivo • distruzione • acidi nucleici • mutazioni • alterazioni espressione genica • proteine • alterazioni di struttura • perdita funzioni enzimatiche • perdita funzioni di trasporto • perdita funzioni recettoriali

  10. Il ruolo cruciale del LAB Antiossidanti ENZIMATICI NON ENZIMATICI endogeni NON ENZIMATICI esogeni 1 Perossidazione LIPIDI Ossidazione PROTEINE Ossidazione DNA 2 3 Radicali ROS, RNS, RGS Non radicali H2O2

  11. Misura della Capacità Ossidante Totale • d-ROMS (Diacron International, Grosseto) • FORT (Callegari, Parma)

  12. Capacità ossidante totaleRadicals Oxygen Metabolites Test (d-ROMs test) Diacron International – Grosseto, Italy • Reazione di Fenton: i metalli di transizione (es. Fe) catalizzano la scissione degli idroperossidi (ROOH) in derivati radicalici secondari (alcossilici RO•e perossilici ROO•): questi reagiscono con un derivato amminico che si trasforma in un catione radicalico colorato. • ROOH + Fe2+RO•+ OH-+ Fe3+ ROOH + Fe3+ROO•+ H++ Fe2+ RO•+ ROO•+A-NH2RO- + ROO- + H+ + [A-NH2•+] • Calibrazione con H2O2: risultato in unità CARR o mg H2O2 /dL equivalenti

  13. HCY, DANNO VASCOLARE e STRESS OSSIDATIVO • Meccanismi di istolesività non del tutto noti • Dimostrati: • Antagonismo sintesi e funzione dell’NO endoteliale (riduzione azione vasodilatante) • Formazione di anione superossido (O2-)e conseguentemente di perossinitrito (NO3-) • Proliferazione fibre muscolari lisce, aumento adesione endoteliale e deposizione LDL (correlazione iperHcy e aumento oxLDL) • Attivazione piastrinica con adesione e aggregazione • Attivazione fattore V endoteliale

  14. ANTIOSSIDANTI ENZIMATICIo PRIMARI Detossificano la cellula dai ROS con reazioni in cui le specie radicaliche perdono la loro reattività e vengono trasformate in sostanze innocue ANTIOSSIDANTI NON ENZIMATICIo SECONDARI Implementano le difese antiossidanti (es. ripristinando il pool dei tioli) ed agiscono di per sé come scavengers

  15. Gli antiossidanti ENZIMATICI • SODO2•- • Catalasi, PerossiredoxinaH2O2 • GSH perossidasiidroperossidi organici • GSH reduttasiidroperossidi organici • GSH S-transferasi substrati ossidati • Tioredoxina reduttasi, Glutaredoxina e Nucleoredoxinaomeostasi redox + trasduzione + modulazione del segnale La nutrizione svolge un ruolo fondamentale nel mantenere l’efficacia delle difese enzimatiche antiossidanti Oligoelementi essenziali (selenio, rame, manganese e zinco) sono coinvolti nella struttura molecolare o nell’attività catalitica

  16. Gli antiossidantiNON ENZIMATICI ENDOGENI • Glutatione (GSH) • Coenzima Q10 (Ubichinone) • Acido urico • Bilirubina • Melatonina • Tioredoxina

  17. Gli antiossidantiNON ENZIMATICI ESOGENI • Vitamine liposolubili • Vitamina A (retinolo + 3-deidroretinolo) e carotenoidi (luteina, zeaxantina) • Vitamina E (a-tocoferolo) + famiglia dei tocoferoli e tocotrienoli • Vitamina K (fitil-menachinone) • Vitamine idrosolubili • Vitamina C (acido ascorbico) • Acido Lipoico • Polifenoli e Flavonoidi • Micronutrienti (selenio, rame, zinco)

  18. Misura della Capacità Antiossidante Totale (TAC) • Liquidi biologici • Plasma • Saliva • Liquido seminale • Alimenti • Bevande • Oli • Frutta e vegetali

  19. Antiossidanti non enzimatici endogeniGlutatione (GSH) • tripeptide Glu-Cys-Gly • biodisponibilità: dipende da azione di enzimi (GRed, GPx, G6PDH) e disponibilità di cofattori (NADPH, da vit. PP) • deficit congenito di G6PDH o GSH = gravi alterazioni membrana RBC • in molte vie metaboliche • coenzima • substrato • trasporto (aminoacidi, gruppi NH2, peptidi) • azioni • antiossidante • detossificante (alcool, additivi, coloranti, derivati toluolo, benzolo, etc.) • chelante (metalli pesanti) • nella frutta e vegetali crudi(avocado, cocomero, asparagi, pompelmo, patate, fragole, pomodori, arance, melone, carote, spinaci, pesche)

  20. Vitamina C Vitamina A beta Carotene Licopene Antiossidanti non enzimatici esogeni

  21. Perossidazione lipidica (1) • Sottrazione H+ da un gruppo metilenico adiacente a un doppio legame di un PUFA • Formazione di radicale centrato su un atomo C• • Riarrangiamento del doppio legame con formazione di un dieneconiugato • Reazione O2 con radicale C• e formazione di radicale perossile ROO• • Reazione del radicale perossile con altro PUFA e formazione di un idroperossido (ROOH) + un altro radicale centrato sul C•

  22. Perossidazione lipidica (2) • Gli idroperossidi lipidici possono reagire ulteriormente e formare: • perossidi ciclici • aldeidi a-b-insature (MDA, acroleina, 4HNE) • pentano ed etano • dieni 2,3 trans-coniugati • isoprostani • colesterolo-ossidi Le aldeidi prodotte da LPO sono chimicamente reattive vs proteine ed acidi nucleici: contribuiscono ad amplificare ulteriormente il danno radicalico

  23. Misura della Perossidazione lipidica • TBARSeMDA fotometria (TBA test), HPLC-FL (TBA test), ELISA, immuno-istochimica • 4-HNEHPLC-FL, immuno-istochimica ELISA • F2-isoprostani GC-MS, ELISA, RIA • Dieni coniugati spettrofotometria • Lipoperossidi GC-MS, spettrofotometria • Lp-CHOLOXspettrofotometria • LDL oxELISA, immuno-istochimica

  24. Ossidazione proteica (1) • Ossidazione di residui aminoacidici • Alifatici → Gruppi carbonilici → Idroperossidi e perossidi di Val, Leu, Lys • Aromatici → Tyr-derivati → Trp-derivati (chinurenina) • Tiolici → Met-sulfossido e Met-sulfone → Cys disolfuri • Le modificazioni ossidative causano: • frammentazione • alterazione strutturale • aggregazione • perdita di funzionalità

  25. Misure di ossidazione proteica • Carbonili spettrofotometria, immunoistochimica, ELISA, Western Blot • Prodotti di ossidazione della Tyr • NO2-TyrGC-MS, HPLC-UV • Cl-TyrELISA • Br-Tyr Western Blot, immunoistochimica • Tyr-Tyr LC-MS/MS • Prodotti di glicazione ELISA • Neo-epitopi Western Blot, immunoistochimica • Prodotti ossidazione singoli aminoacidi

  26. Ossidazione del DNA • ROS (soprattutto •OH) causano mutazioni di basi e rotture doppia elica • 8-idrossi-deossi-guanosina (8-OHdG): marcatore di danno a carico dei soli residui di guanina • catene nucleotidiche da estratti tissutali: 8OHdG/2dG ratio • plasma: free e protein-bound • urine: free • metodi ELISA e HPLC

  27. Il CSOx LABun laboratorio di 2° livello

  28. Il ruolo cruciale del CSOx LAB 2 BAP test SOD GSH/GSSG Vitamina C Vitamina E Vitamina A b-Carotene Licopene Quadro generale metabolico 35 parametri + IL-6 1 CHOLOx test 4-HNE 3-NT 8-OHdG CoQ10 3 d-ROMs test Omocisteina

  29. Il referto del CSOx

  30. Il referto del CSOx

  31. Il referto del CSOx

  32. Commento al referto

  33. Stress ossidativo: ruolo fisiologicoTarget intracellulari dei ROS I ROS regolano l’attività di tirosina-fosfatasi per ossidazione del gruppo –SH di alcune Cys reattive: • Sulfonazione (RSO3H) • Nitrosilazione (RSNO) • Glutationilazione (RSSG) • Disolfuri intra- o inter-molecolari (RSSR)

  34. Stress ossidativo e tumori“…ROS both accelerate and delay cancer initiation and progression…” • Azione ossidante-mutagena = citotossica, tumorigenica • Azione di trasduzione del segnale = attivazione di vie metaboliche di proliferazione, differenziamento e adattamento metabolico • Meccanismo ROS bifasico: • PRIMA citotossico, tumorigenico • POI di stimolazione e potenziamento della barriera antiossidante cellulare (pool GSH e tioredoxina ridotti)

  35. Lo stress ossidativo è un’ alterazione dell’equilibrio omeostatico tra specie ossidanti e barriera antiossidante; • Lo stress causa dannose alterazioni strutturali e funzionali di proteine, lipidi e DNA; • Il laboratorio studia e quantifica i 3 elementi in gioco: ROS, barriera antiossidante, danni ossidativi; • Valutare i livelli di stress per contrastarne l’insorgenza può migliorare lo stato di salute e prevenire o rallentare le patologie cronico-degenerative

  36. GRAZIE PER L’ATTENZIONE “…Il guerriero della luce presta attenzione alle piccole cose …” Paulo Coelho

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