BIOPSIA INTESTINULUI SUBTIRE

1. BIOPSIA INTESTINULUI SUBTIRE CONF. DR. EUGEN CIRDEIU CLINICA III PEDIATRIE UMF - IASI

2. BIS – introdusa in practica pediatrica de catre Sakula si Shiner in 1957 a permis: • Imbunatatirea intelegerii patologiei IS • Cunoasterea functionalitatii normale a IS • Se poate realiza: • Biopsia de aspiratie – la nivelul unghiului duodeno-jejunal • Biopsia pe cale endoscopica – la nivelul celei de-a II-a portiuni a duodenului. • Biopsia endoscopica – permite si vizualizarea tractului gastrointestinal superior, cu posibilitatea efectuarii concomitente a biopsiei esofagiene, gastrice, • Se poate realiza si la pacienti cu greutate mica, dar mai mare de 1,8 kg.

3. TEHNICA BIS BIOPSIA PRIN ASPIRATIE • Dupa un post de o noapte (se pot administra mici cantitati de apa la cerere) – sugarii pot primi pranzul de la ora 22, si, uneori, de la ora2. • Sedare in dimineata biopsiei (ex. – Trimeprazine, cloralhidrat, metoclopramid sau daca devine agitat – Diazepam iv, max 0,5 mg/kg – este necesara prezenta echipamentului de resuscitare, iar hipertrofia amigdaliana si orice afectare a cailor aeriene superioare - contraindicatii) • Introducerea capsulei se realizeaza cu ajutorul unui depresor lingual cu plasarea capsulei la baza limbii, ulterior depresorul se retrage, se sustine barbia iar capsula este inghitita. Tubul avanseaza usor pana cand capsula ajunge in stomac. Copilul se pozitioneaza in decubit lateral drept si se depaseste pilorul. • Pentru verificarea pozitionarii capsulei – 2 posibilitati: • Fluoroscopia (tehnica preferata) • Rg abdominala – date exacte privind pozitia capsulei. • De asemenea, este utila insuflarea de aer in stomac – scurteaza durata si trebuie monitorizat timpul de fluoroscopie – sa nu depaseasca 2 min. • Introducerea Metoclopramidului pe tub in doza de 2,5 mg sub 2 ani si 5 mg peste 2 ani – accelereaza pasajul la nivelul pilorului. • De asemenea, Cisapridul (0,2-0,3 mg/kgc) – acelasi efect • Dupa pozitionarea in portiunea a 4-a a duodenului, unghiul duodenojejunal, sau prima ansa jejunala se aspira cu o seringa de 20 ml, cu retragerea ulterioara a capsulei.

4. Ideal, probele trebuie prelevate dintr-un loc standard. • Daca pt pozitionare s-a injectat un lichid radioopac pe sonda, trebuie injectat 2 ml de apa, apoi 2 ml aer, urmat de utilizarea capsulei. • De asemenea, se poate obtine suc duodenal - ex microscopic cu contrast de faza pt identificarea – giardia lamblia + cultura – infectie sau suprapopulare bacteriana.

5. BIOPSIA ENDOSCOPICA Se efectueaza in timpul endoscopiei digestive superioare Diagnosticarea patologiei gastrice si esofagiene coexistente (esofagita de reflux la copiii cu IPLV) Exista discutii privind sedarea iv profunde si anesteziei generale in endoscopia pediatrica – necesita prezenta unui specialist calificat pt monitorizarea pacientului – saturatie O2, echipament de resuscitare (anestezist calificat sau un gastroenterolog pediatru bine pregatit). Endoscopia – a permis detectarea leziunilor parcelare ale IS (ex. Enteropatia din IPLV) Cu endoscoape f mici se poate realiza endoscopia la copii cu G sub 2 kg. Un rol important in diagnosticul corect – manipularea probelor – ex. punerea fragmentului bioptic in formol – riscul contractiei stratului muscular longitudinal – nu afecteaza dgn de BC, dar face imposibil dgn enteropatiei

6. Prelevarea si transportul probelor • Dupa retragerea capsulei sau forcepsului de biopsie fragmentul bioptic trebuie rapid luat cu un instrument bont si depus pe o lama cu suprafata mucoasa in sus. Ulterior, lama si proba se depun in ser fiziologic rece – 4 grade C. • Proba va fi examinata la microscopul de disectie (aspectul mucoasei) sau se vor efectua alte studii pt care trebuie evitata fixarea in formalina – microscopie electronica, evaluarea activitatii dizaharidazei, imunohistochimie. • Ulterior, probele vor fi fixate in formalina tamponata cu fosfat 10% si prelucrate pt ex histologic si vor fi taiate 1-20 de sectiuni, montate pe sticla si colorate hematoxilina si eozina si PAS.

7. Precautii igienice: • utilizarea manusilor in manipularea capsulei de biopsie sau a forcepsului endoscopic. • Forcepsul – dezinfectat in sol glutaraldehida 2% • Capsula de biopsie spalata si dezinfectata cel putin 10 min in gluconat de clorhexidina 0,5% si in alcool 70%, dupa care minim 1 ora in sol de glutaraldehida activata 2%, apoi clatita f binhe si uscata. • atentie deosebita in manipularea glutaraldehidei – utilizarea echipamentului de protectiesi ventilatie adecvata.

8. Aspecte morfologice Microscopia de disectie • Permite studiul aranjamentului 3D al mucoasei • Permite examinarea in totalitate a probei - identificarea leziunilor parcelare • Recunoasterea oricarui artefact, cu repetarea biopsiei, pacienul fiind sedat. • Dgn rapida a prezentei /absentei atrofiei vilozitare. • Permite parintilor sa observe mucoasa plata si sa constientizeze importanta regimului fara gluten, in special in proba de provocare cu gluten, cand simptomatologia clinica poate lipsi. • Permite prelevarea altor probe de dimensiuni mai mici pt alte investigatii (ME, evaluarea dizaharidazei).

9. Limitele metodei - daca nu se lucreaza cu atentie se poate amana fixarea, ducand la autoliza, cu erori de diagnostic. La adultii normali mucoasa IS se caracterizeaza prin vilozitati sub forma de deget (in principal) + in forma de frunza. La copil – vilozitati cu aspect de “limba”, iar cand sunt exrem de largi se foloseste termenul de vilozitati sub forma de “inel” – intalnit frecvent la copiii in primii 5 ani. Aspectul de frunza, limba al vilozitatilor IS proximal – aspect normal la copii. Wrigt si colaboratorii – la copil timpul de tranzit al cel epiteliale in cripte este cu 40% mai mic decat la adult, iar indexul mitotic cu 20% mai mare. Deci, in copilaria precoce aria suprafetei mucoasei este redusa si turnover-ul celular epitelial mai mare Aspectele patologice obs la microscopul de disectie: • Mucoasa plata • Mucoasa cu circumvolutiuni. In ambele situatii se pierde arhitectura vilozitarra normala. Scurtarea usoara a vililor este greu de apreciat la microscopul de disectie, spre deosebire de modificarile parcelare.

10. Microscopia de disectie permite: • Identificarea leziunilor parcelare • Identificarea foliculilor limfoizi- mai frecventi intre 1 si 2 ani, rari peste 6 ani. • Vizualizarea limfaticelor dilatate. Endoscopia permite vizualizarea placilor Peyer ileale.

11. Microscopia optica (MO) • Dupa colorarea cu HE – examinarea in MO • Primele raportari au clasificat modificarile patologice ale IS in atrofie vilozitara subtotala (AVS) si partila (AVP). • Atrofie vilozitara subtotala – mucoasa plata, cu ingrosarea stratului glandular, cu epiteliu atrofic, iar AVP – modificari mai putin evidente. • AVP – a fost impartita in usoara si severa. • Alti autori – AV totala pentru a descrie mucoasa aplatizata. • In mod curent, cei mai multi anatomopatologi folosesc termenul de atrofie vilozitara cu hiperplazia criptelor - cel mai frecv observata la nivelul mucoasei IS. • Daca inaltimea vililor si adancimea criptelor este aprox egala + anomalie usoara sau minora • Adancimea criptelor mai mare ca inaltimea vililor – anomalie moderata. • Apaltizarea mucoasei – anomalie severa. • Sunt si situatii cu AV cu cripte normoplazice. • Parametrii analizati – clasificarea aspectului histologic a fost centrata pe inaltimea vilozittilor si adancimea criptelor.

12. Aspectul histologic normal S-a realizat pe fragmente obtinute de la: • Copii cu obs boala GI dar care au avut BI normale • BI de control la copiii sub RFG • Studii postmortem. Concomitent se studiaza: • Prezenta microorganismelor intraluminale, atasate de mucoasa sau intramucoase.- G Lamblia, Criptosporidium, E Coli enteropatogen.

13. Studiul celulelor epiteliale • evaluarea statusului epiteliului, in particular al ENTEROCITULUI – dimensiuni, grad de vacuolizare. De ex, in abetalipoproteinemie si hipobetalipoproteinemie – vacuolizare extensiva a epiteliului, dar nu trebuie confundat cu un grad mai mic de vacuolizare din BC si sdr postgastroenteritic (cand se gasesc fecvent la nivelul varfului vilozitatilor in enteropatiile severe). • Epiteliul criptelor – studiat nr mitozelor - indice privind productia de celule si nr de celule caliciforme. • Se evalueaza cel Paneth si cel endocrine (displazia cel Paneth – in turnover celular crescut, iar cresterea cel endocrine - in BC ). • cel intraepiteliale - limfocite, eozinofile, neutrofile, mastocite. • Determinare nr limfocite/100 de celule epiteliale - important in BC unde nr este crescut (la copiii cu caractere histologice normale – valoare medie de 23). De asemenea, la adultul cu dermatita herpetiforma, sprue tropical, copii cu MPC, giardiaza, criptosporidiaza, IPLV – nr LIE revine la normal sub RFG in BC • Eozinofilele intraepiteliale cresc in IPLV, iar neutrofilele se gasesc in boala inflamatorie intestinala sau , ocaional, in BC activa.

14. Lamina propria (LP) Studiul LP – gradul si natura infiltratului celular. Pentru identificarea fenotipului celular – tehnici de imunohistochimie (ex – sublase de limfocite, citokine specifice). Pentru studiul mastocitelor – sol Carnoy ca fixator si colorare ulterioara – valoare dgn limitata. Coloratia PAS – permite conservarea marginii in perie si vizualizeaza celulele ce contin mucus. Prezenta materialului PAS + in citoplasma apicala a criptelor superioare si cel epiteliale vilozitare de la baza – indica atrofia microvililor. Mucusul PAS + din lumenul criptelor sugereaza fibroza chistica.

15. MICROSCOPIA ELECTRONICA (ME) ME de transmisie si ME de scanare – utilizate pt studiul caracterelor morfologice ale mucoasei IS. In prezent studiile ultrastructurale sunt efectuate de rutina in cazul diareei prelungite. Permit evidentierea – atrofiei microvililor, atasarea E coli, criptosporidiaza. Fragmentele bioptice de la pacientii cu SIDA – studiate in ME deoarece multi agenti infectiosi depasesc rezolutia MO.

16. STUDII BIOCHIMICE Se utilizeaza pt deficientele primare/sec de dizaharidaze sau permit dgn unor boli rare, ca de ex, defectul de transport Na –H.

17. IMUNOHISTOCHIMIA Precizeaza natura raspunsului inflamator: natura oligo sau policlonala, tipul de receptor T celular al LIE. Ofera importante informatii in diagnosticul enteropatiei si studiul mecanismului bolii. Accesul la multitudinea de markeri diagnostici necesita utilizarea tesutului congelat, deoarece fixarea cu formalina leaga incrucisat proteinele tisulare si poate altera structura tertiara astfel incat sa nu permita recunoasterea anticorpilor. Aceasta posibilitate de studiu are o mare importanta in enteropatia autoimuna – vizualizeaza Li activate ale mucoasei in asociere cu expresia CMH de clasa II la nivelul epiteliului de suprafata.

18. IMUNOHISTOCHIMIA A fost utila in BC – rolul Li CD4 din lamina propria in patogenia bolii. Analiza imunohistochimica se poate extinde la cercetarea citokinelor.

19. Biologia moleculara Permite detectarea ARNm pentru proteine specifice. Daca probele de biopsie sunt mogenizate, ARN m se poate detecta prin Northern blootting sau PCR. – detectarea si estimarea semicantitativa a ARNm, dar nu permite localizarea in tesut. Hibridizarea in situ permite localizarea ARNm specific in celule individuale. Aceste tehnici sunt inca rezervate pt cercetare, desi detectarea patogenilor virali sau bacterieni (CMV, mycobacterii) a fost realizata. Hibridizareain situ necesita tesut congelat, desi ARNm pt unele molecule poate fi detectat in tesutul fixat cu formalina dupa digestie proteolitica pt evidentierea secventelor de ARN. Utilizarea hibridizarii in situ in studiul functiei IS a fost demonstrata in studii pe animale (existenta CMH clasa II pt prezentarea Ag limfocitului T in epiteliul IS la soarece s-a demosntrat ca depinde de introducerea unei diete complexe la intarcare; expresia genei co-transportorului Na-glucoza a fost maxima la nivelul jonctiunii cripta-vilozitate la iepuri, desi activitatea enzimatica a fost maxima la varful vilozitatii )

20. IZOLAREA LIMFOCITELOR (Li) - din probele de biopsie se pot obtine celule inflamatorii individuale – cel epiteliale si LIE pot fi extrase prin separarea de restul biopsiei folosind etilendiamintetraacetic acid (EDTA). Li laminei propria pot fi obtinute prin digestia tesutului remanent cu colagenaza, iar subpopulatiile de Li se separa prin centrifugare in functie de densitate, urmat de extragere prin camp magnetic. Ulterior, se separa pe baza markerilor de suprafata prin analiza de sortare a celulelor fluorescent activate (FACS), care pot fi folosite si pentru demonstrarea secretiei spontane de citokine. Alte tehnici – masurarea nivelului de supernatant dupa stimularea celulara si utilizarea imunospotului (ELISPOT)

21. CULTURA DE ORGAN IN VITRO Tesuturile de IS cultivate de la pacientii cu BC arata imbunatatirea caracterului morfologic daca sunt cultivate in absenta glutenului, in timp ce adaugarea de gliadina stimuleaza expresia HLA – DR pe cel epiteliale in vitro. Culturile in timp scurt (8h) au o valoare particulara in studiile experimntale ale patogeniei microbiene.

22. ROLUL BIS IN DIAGNOSTIC BIS are 2 roluri principale in dng pediatric: • Demonstrarea prezentei sau absentei enteropatiei IS proximal (enteropatia poate fi definita ca o anomalie a mucoasei IS care poate fi demonstrata in MO). • Furnizarea fragmentului de mucoasa pt alte scopuri diagnostice – ex evaluarea dizaharidazelor. Biopsiile aranjate ale IS sunt uneori necesare inaintea unui dgn final. De ex, in BC, biopsiile inainte si dupa proba cu gluten. Recomandarile actuale ESPGAN recomanda proba de provocare urmata de BI doar la copiii mici sub 2 ani. Sunt boli in care BIS are o valoare invariabila in stabilirea diagnosticului (boli in care enteroptia este o conditie necesara pt stabilirea diagnosticului sau in care exista un deficit enzimatic). Demonstrarea enteropatiei este o condite absoluta pentru BC, dar nu este specifica acestei boli (exista si alte boli care evolueaza cu aplatizarea mucoasei IS).

23. Enterocitul in abetalipoproteinemie nu poate sintetiza betalipoproteine – afectata producerea chilomicronilor – citoplasma celulelor ce delimiteaza ½ superioara sau 2/3 din vili apare vacuolizata in sectiuni colorate in HE. Prin coloratii speciale aceste celule pot fi vazute ca incarcate cu grasimi. Un aspect similar – betalipoproteinemie. • Copiii cu agamaglobulinemie nu au plasmocite in lamina propria, dar arhitectura mucoasei poate varia de la aplatizarea mucoasei pana la aspect normal. • In enteropatiile autoimune – mucoasa sever afectata , uneori cu apalatizare; demonstrarea unei enteropatii in prezenta Ac circulanti anti enterocit la un copil cu diaree cronica este esentiala pentru diagnostic. Studiile imunologice sunt esentiale la acesti pacienti pt identificarea optiunii terapeutice.

24. Atrofia microvililor – dgn prin demonstrarea incluziilor microvilare si o crestere a granulelor secretorii la ex in ME a probelor de biopsie mucoasa a IS. O acumulare anormala PAS + apare in citoplasma apicala a cel epiteliale si corespunde cresterii granulelor secretorii vazute in ME. • Prezenta bacteriilor aderente poate fi obs in MO, dar ME este importanta pt dgn infectiei cu E Coli enteropatogen. Recunoasterea unei enteropatii cu identificarea bacteriilor cauzatoare de leziuni permite initierea terapiei cu antibiotice. Serotipuri non-clasate de E coli pot produce leziuni intestinale, iar studiul microbiologic al materiilor fecale nu le-ar identifica.

25. La copiii cu alactazie congenitala sau deficienta de sucraza-izomaltaza au mucoasa normala dpdv morfologic, dar deficitele enzimatice sunt prezente la evaluarea dizaharidazelor. • In cazul leziunilor parcelare sau a celor provocate de un parazit, BIS poate furniza dgn specific.Dar, in leziunile distale intestinale, dgn este stabilit de ex microbiologic al materiilor fecale. • Trofozoitul Giardia Lamblia se gaseste in sucul duodenal, dar si pe sectiunile de BIS. • Cryptosporidium – vizualizat in MO sau ME. • Limfangiectazia IS – dgn prin biopsia mucoasei IS, dar sunt necesare BIS multiple, leziunea fiind parcelara.

26. In hipogamaglobulinemie – pot fi prezenti foliculi limfoizi hiperplazici si un nr redus de plasmocite si variate modificari morfologice, iar giardia poate fi gasita frecvet in lichidul duodenal. • Sunt afectiuni in care leziunea intestinala desi este nespecifica, BIS este utila pentru diagnostic deoarece indica prezenta bolii la nivelul IS.

27. AFECTIUNI IN CARE BIS ESTE NESPECIFICA

28. Unele afectiuni (ex IPLV) pot fi dgn prin BIS seriate legate de scoaterea proteinelor din dieta si proba de provocare, desi nu exista caracterisici morfologice specifice acestei afectiuni.