Abelhas sem ferrão no monitoramento de resíduos de pesticidas e qualidade do mel

1. Abelhas sem ferrão no monitoramento de resíduos de pesticidas e qualidade do mel Profa. Dra. Maria Claudia CollaRuvoloTakasusuki

2. Polinizadores de muitas espécies de plantas cultivadas e matas naturais • São responsáveis por até 90% da polinização em áreas naturais • O que acontece se esses insetos se contaminam com pesticidas ou outros compostos xenobióticos? • O que acontece com a sua cria, o ninho, a colmeia e com os seus produtos que muitas vezes são utilizados por nós?

3. Relatos de casos de sumiço de abelhas nativas sem ferrão – Paraná • Será que os pesticidas, em especial inseticidas podem estar relacionados com esse sumiço? Caixa abandonada deLeurotrigonamuelleriCambé-PR Caixa abandonada de Plebeia droryanaCambé-PR

4. Esse desaparecimento de abelhas sem ferrão está muito parecido com a Desordem do Colapso das Colônias (CCD) descrita para as abelhas Apismellifera – primeiro relato em outubro de 2006 na costa leste dos EUA • CCD - ausência de abelhas vivas ou morta na colônia, mas com a presença de crias e alimento, podendo ser encontrado, em alguns, uma pequena quantidade de operárias e a rainha dentro da colmeia. • Em colmeias em há operárias observa-se uma relutância da colônia em consumir o alimento energético ou proteico fornecido. • Prováveis causas da CCD em A. mellifera: • uma nova doença que acomete as abelhas – parasita ou patógeno • envenenamento por defensivos agrícolas • desnutrição • alto nível de consanguinidade • estresse ambiental • manejo apícola inadequado

5. CCD pode estar afetando as abelhas nativas sem ferrão? • Será que as causas são as mesmas que afetam as A. mellifera? • Um dos fatores seria a ação de pesticidas como inseticidas e herbicidas

6. Por que estudar os efeitos de agrotóxicos em jataí? • Ocorrência alta • Facilidade de criação • Facilidade de manutenção • Espécies de Tetragoniscae sua distribuição • Tetragoniscaangustula(Latreille, 1811) – Ocorre do México, América Central e América do Sul • Tetragoniscafiebrigi(Schwarz, 1938) – Brasil (Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Paraná, Rio Grande do Sul, São Paulo), Argentina, Bolívia e Paraguai • Tetragoniscaweyrauchi(Schwarz, 1943) – Bolívia, Perú e Brasil (Acre, Mato Grosso, Rondônia) • Tetragoniscabuchwaldi (Friese, 1925) – Costa Rica, Panamá e Equador

7. Tetragoniscaweyrauchi – jataí acreana Tetragoniscafiebrigi Tetragoniscaangustula

8. Toxicidade dos inseticidas medida CL50 (concentração letal que proporciona a morte de 50% da população) • Quatro classes de agrotóxicos de acordo com a CL50 para abelhas: • Classe 1- extremamente tóxicos CL50 > 2μg/abelha • • Classe 2- altamente tóxicos CL50 entre 22μg e 10,99μg/abelha • • Classe 3- moderadamente tóxicos CL50 entre 11μg e 100μg/abelha • • Classe 4- pouco tóxicos CL50 < 100μg/abelha • (Larini, 1999; Hunt, 2000)

9. Abelhas jataí TetragoniscaangustulaeTetragoniscafiebrigicomo bioindicadores • Trabalho desenvolvido por Ana Lucia Paz Barateiro Stuchi – tese de doutorado – Pós-Graduação em Zootecnia (2005 a 2009) • Nesse estudo foram avaliadas as alterações ocorridas na expressão gênica de abelhas do gênero Tetragoniscaapós contaminação com agrotóxicos para, posteriormente, utilizar esses insetos como bioindicadores de agrotóxicos.

10. + A B EST-2 EST-3 EST-4 EST-4 EST-1 Perfil eletroforético das esterases em gel de poliacrilamida. A = extratos de cabeça/tórax de operárias de Tetragoniscafiebrigi e B = extratos de cabeça/tórax de operárias de Tetragoniscaangustula. (Sociobiology, v. 59, n. 1, 123-134,2012)

11. Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas Tetragoniscafiebrigi submetidas ao fipronil, malathion, neem e thiamethoxam, tanto por contato (papel filtro) como por ingestão (alimento)

12. Inibição da atividade das esterases detectada em T. fiebrigi após contato com fipronil, malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (++) aumento de intensidade da banda

13. Inibição da atividade das esterases detectada em T. fiebrigi após ingestão de fipronil, malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial

14. + Controle Malathion EST-4 EST-3 Perfil eletroforético das esterases de extratos de cabeça/tórax de T. angustula,mostrando a inibição parcial da EST-3 e EST-4, após contaminação por contato com o inseticida malathion na concentração de 0,003%.

15. Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas T. angustula submetidas ao fipronil, malathion, neem e thiamethoxam, tanto por contato (papel filtro) como por ingestão (alimento)

16. Inibição da atividade das esterases detectada em Tetragoniscaangustula após contato com malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial

17. Inibição da atividade das esterases detectada em T. angustula após ingestão de malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial

18. Abelhas jataí bioindicadores da presença de resíduos de Herbicidas Trabalho desenvolvido por Fábio Fermino – Dissertação de mestrado – Pós-Graduação em Genética e Melhoramento (2008 a 2010)

19. Mortalidade de T. angustula nos bioensaios com os herbicidas nicosulfuron(Sanson 40 SC®) e paraquat (Gramoxone 200®) após 24h de exposição.

20. Inibição da atividade das isoenzimas malatodesidrogenase (MDH), superóxido dismutase (SOD) e esterase (EST) detectada em T. angustula após contato com Nicosulfuron e Paraquat. (+) ausência de inibição; (+-) inibição parcial; (-) inibição total; (++) aumento na expressão.

21. Inibição da atividade das isoenzimasmalatodesidrogenase (MDH), superóxidodismutase (SOD) e esterase (EST) detectada em T. fiebrigi após contato com Sanson e Paraquat. (+) ausência de inibição; (+-) inibição parcial; (-) inibição total; (++) aumento na expressão.

22. ALTERAÇÃO DA EXPRESSÃO DE ESTERASES E PROTEÍNAS TOTAIS DE tetragoniscaangustulaLatr.VISITANTES DE FLORES DE CAFÉ (CoffeaarabicaL.) APÓS PULVERIZAÇÃO COM O INSETICIDA neem Trabalho desenvolvido por Mayra Cristina de Araujo – Monografia – especialização em Biotecnologia aplicada a agroindústria - UEM Vista da entrada do ninho de T. angustulautilizado no bioensaio durante a florada de cafezal em Apucarana-PR Vista da florada de cafezal (C. arábica) em Apucarana-PR - 2009

23. Local: Cafezal do Sítio Penitente em Apucarana – Paraná • Início da florada (botões florais começando a abrir) cafeeiros foram pulverizados com o inseticida neem comercial • Caixa comerciais de jataí foram instaladas como segue a aproximadamente 100m do pés de café: • Tratamento: uma das caixas foi instalada a 100m de uma fileira lateral e 24 horas depois foi realizada a aplicação do inseticida comercial neem de acordo com as instruções constantes da embalagem; • Controle: A segunda caixa de jataí foi instalada na extremidade oposta a aproximadamente 600m de distância da caixa anterior e 24 horas depois foi realizada pulverização apenas com água.

24. Operárias adultas foram coletadas na entrada do ninho tratado e controle após: • 24h • 48h • 72h • Análise das esterases: inibição parcial das EST-3 e EST-4 após 48h da contaminação, em comparação com o controle. • Análise das proteínas totais: ocorreu um aumento na quantidade de peptídeos após 24h da contaminação • No campo foi observado que: • os pés de café pulverizados com neem repeliram parte das T. angustulaque estavam forrageando • e que não houve mortandade de abelhas após a aplicação do inseticida.

25. Análise da expressão gênica em TetragoniscaangustulaL. após a contaminação com inseticidas • Trabalho desenvolvido por Carlos Vinício Prescinato De Oliveira– Dissertação de mestrado – Pós-Graduação em Genética e Melhoramento

26. Inseticidas reguladores de crescimento • Galaxy EC 100 – princípio ativo Novaluron • Natuneem – extrato da planta neem (Azadirachta indica )– princípio ativo azadiractina • AzaMax – princípio ativo azadiractina • Contaminação por contato dentro das colmeias por longo período de tempo • Concentrações subletais • Bioensaios realizados no setembro de 2010 a outubro de 2011

27. Gallaxy EC 100 princípio ativo - novaluron(100g/L), é um inseticida regulador de crescimento que atua principalmente na síntese da cutícula do inseto, inibindo a síntese de quitina e, consequentemente, inibindo a muda do inseto. • Azadiractina - pode afetar a sobrevivência, causar repelência, deterrente alimentar (impede que outros organismos se alimente da planta), regular o crescimento, reduzir a fertilidade de fêmeas, causar anormalidades anatômicas, provocar efeitos histopatológicos prejudiciais em glândulas produtoras de neurôrmonios, em tecidos reprodutivos e em células epiteliais do intestino, afetar o metabolismo de proteínas em insetos.

28. Diluições dos inseticidas utilizados nos experimentos

29. Procedimento experimental • Inseticidas diluídos em água destilada • Aplicou-se 01 mL do inseticida diluído em folha de papel filtro (12,5 ± 0,1 cm) – colocadas para secar. • Folhas de Papéis filtros contaminadas foram introduzidas no interior dos colmeias • Controle – mesmo procedimento para os ninhos contaminados, porém aplicou-se apenas 01 mL de água destilada

30. Coletas de operáriaspara análise das esterases e proteínas totais: • 48 horas • 120 horas • 168 horas • 30 dias • 60 dias

33. Eletroforese SDS-PAGE 7% de T. angustula após a exposição ao inseticida Gallaxy EC 100 6,25% por 120 horas, coloração nitrato de prata. Os asteriscos seguidos de letras são para identificar horizontalmente as regiões de peptídeos afetados. P.M: padrão de peso molecular. 01-09: controle. 11-20: tratados.

34. Após 48 horas da contaminação com AzaMax a 5% não foi possível coletar abelhas na entrada do ninho - nos períodos de forrageamento, manhã e tarde, a partir de 48 horas após contaminação a quantidade de abelhas na entrada do ninho e forrageando diminuiu drasticamente ao longo dos dias. Nenhuma abelha morta foi encontrada no entorno do ninho. • seria a ação repelente do AzaMax?

35. Pesticidas em concentrações subletais alteram a expressão de esterases e de proteínas solúveis em abelhas T. angustulae T. fiebrigi • Essas alterações refletem o metabolismo intermediário dessas abelhas – detoxificação • O aumento de síntese de proteínas pode estar levando essas abelhas a apresentarem uma resposta ao estresse ambiental (presença do pesticida) que pode ser: • Nova proteína sintetizada • Comportamental, por exemplo: alteração na orientação, abandono do ninho

36. Questões a serem respondidas • A rainha é afetada pelos pesticidas? E a cria? • Há contaminação do mel e pólen? • Com quais pesticidas ocorre alteração comportamental ? Quais alterações? • Quais as concentrações míneemas que afetam as abelhas e seus produtos?

37. Qualidade do Mel • É importante destacar que a composição exata de qualquer mel depende, principalmente, das fontes vegetais das quais ele é derivado, mas também do clima, solo e outros fatores • Várias metodologias utilizadas para a determinação de resíduos de agrotóxicos são baseadas em métodos cromatográficos • Resíduos de contaminantes também podem ser identificados em amostras de pólen - cromatografia líquida com espectrometria de massa • A presença de resíduos de pesticidas pode ser identificada ainda com o corpo das abelhas – mas não há técnica eficiente. Uma técnica utilizada é a cromatografia gasosa

38. Alguns cuidados que podem diminuir a contaminação com agrotóxicos • Se houver cultivo nas proximidades verificar se há uma grande faixa de vegetação nativa – início da faixa – 1,5 Km da lavoura • Os limites estabelecidos de acordo com o RT (tempo residual) de cada substância devem ser respeitados, e evitar a aplicação de inseticidas que tenham RT acima de 8h.

39. Não se deve fazer pulverizações quando a temperatura estiver muito baixa – porque isso aumenta o RT • Não se aplicar pesticidas durante o pleno florescimento da cultura ou de plantas presente nas proximidades • Usar as formulações menos perigosas quando for possível – formulações granuladas e em solução. Evitar o uso de microcápsulas – liberam o ingrediente ativo gradativamente • As instruções estabelecidas pelos fabricantes devem ser obedecidas, respeitando a quantidade e a forma de aplicação.

40. Obrigada!