OCENA STANU ODPORNOŚCI OWADÓW

1. OCENA STANU ODPORNOŚCI OWADÓW Marek Chmielewski

2. ODPORNOŚĆ • Wrodzona lub nabyta niewrażliwość, względnie zmniejszona podatność organizmu, na czynniki szkodliwe identyfikowane jako „nie własne” (non-self), uwarunkowana genetyczną konstytucją ustroju oraz szeregiem mechanizmów obronnych natury komórkowej i humoralnej.

3. ODPORNOŚĆ PRZECIWZAKAŹNA • organizmu na choroby wywołane przez drobnoustroje. Odczyny obronne powodują likwidację, unieszkodliwienie lub zniszczenie patogenu. W rozważaniach nad odpornością bezkręgowców, obydwie definicje są wykorzystywane, niekiedy wzajemnie się uzupełniają.

4. MECHANIZMY WSPÓLNE DLA WIELU GRUP ZWIERZĄT • Rozpoznanie self or non self • Fagocytoza • Aktywność bakteriobójcza enzymów lizosomalnych fagocytów • Aktywnośc typu lizozymu lub lysozyme-like • Obecność substancji przekaźnikowych (cytokiny, chemokiny)

5. CHARAKTERYSTYKA ODPORNOŚCI BEZKRĘGOWCÓW • nie jest związana z limfocytami B, T i Ig • baza materialna (immunocyty, ciało tłuszczowe) • pojawia się szybko (godziny, dni) • trwa krótko • odporność nabyta nie występuje u wszystkich grup • wyjątkowo cechuje się swoistością • z reguły brak pamięci immunologicznej

6. MECHANIZMY ODPORNOŚCI BEZKRĘGOWCÓW wspólne dla wszystkich grup          charakterystyczne dla większości bezkręgowców charakterystyczne dla typu lub gromady bezkręgowców

7. W wyniku: • zakażeń wirusowych i bakteryjnych • inwazji pasożytniczych • pod wpływem stresu (temperaturowy, pokarmowy, socjobiologiczny) • ulega zaburzeniu odporność wewnętrzna owadów uwarunkowana działaniem humoralnych i komórkowych mechanizmów odporności. • Zaburzenia odporności mogą zostać spowodowane również: • stosowaniem pewnych leków • nieodpowiednimi sposobami ich aplikacji

8. ODPORNOŚĆ PRZECIWZAKAZNA Fizjologiczna(wrodzona) Nabyta (indukowana) • Przeciwzakaźne bariery anatomiczno-fizjologiczne • Odporność sekrecyjna • Odporność behawioralna • Mechanizmy odporności wewnętrznej Cekropiny Attacyny Cecropin like-substances Apidycyny Abacyna

9. PRZECIWZAKAŹNE BARIERY ANATOMICZNO-FIZJOLOGICZNE • Okrywa ciała • Układ tchawkowy • Bariery przeciwzakaźne przewodu pokarmowego • Mechanizmy odporności przeciwzakaźnej przedżołądka • Mechanizmy środowiska biochemicznego jelita środkowego • Antybioza i kompetycja bakteryjna • Błona perytroficzna jelita • Ściana jelita środkowego

10. Odporność sekrecyjna • Mleczko pszczele • Kit pszczeli (propolis) • Układ antybiotyczny miodu • Układ antybiotyczny nektaru • Układ antybiotyczny pyłku Odporność behawioralna • Wykrywanie chorych i martwych osobników, usuwanie z ula, czyszczenie plastrów (hygenic behaviour) 2 recesywne geny • Oczyszczanie (cleanining behaviour) – samooczyszczania (self cleaning), taniec oczyszczający (grooming dance) i oczyszczania grupowe (group cleaning) • Rójka • Mechanizmy chrponiące czerw przed zakażeniem

11. Mechanizmy odporności wewnętrznej KOMÓRKOWE HUMORALNE FAGOCYTOZA INKAPSULACJA NODULACJA Lizozym Układ fenylooksydazy Lektyny Humoralna inkapsulacja Aktywność zbliżona do dopełniacza KOAGULACJA HEMOLIMFY MELANIZACJA KRWI

12. Lizozym • Muramidaza, N-acetylomuramylhydrolaza (EC.3.2.1.1.7) - eznym rozkładający wiązania endo beta (1—4) pomiędzy kwasem N-acetylomuraminowym i N-acetyloglu-kozaminą ściany komórkowej bakterii gram dodatnich. • Lizozym jest białkiem zasadowym o punkcie izoelektrycznym 10,5—1,0 i ma­sie cząsteczkowej około 15 000 stabilnym w kwaśnym pH w wyższych temnpratu-rach, a ulegającym inaktywacji w zasadowym pH.

13. Lizozym • Powoduje on lizę zawiesiny Micrococcus lysodeikticus z następowym uwalnianiem cukrów redukujących i aminokwasów. • Enzym ten działa przeciwbakteryjnie na bakterie gram dodatnie takie jak: M. lysodeikticus, Sarcina lutea i Bacillus subtilis

14. Lizozym • Fizjologiczny poziom lizozymu wynosi w hemolimfie larw Apis mellifera od 5,0 do 10,0 (ug/ml) poczwarek i imago od 5,0 do 25,0 ug/ml). Ten niski wrodzony poziom lizozymu wzrasta kilkakrotnie po zakażeniach i pod wpływem działania stresu, osiągając maksymalne wartości po 24-48 godzinach.

15. Lizozym • Uważa się, że u owadów lizozym jest jednym z głównych czynników odporności humoralnej o działaniu bakteriobójczym. Jest on syntetyzowany de novo w ciele tłuszczowym. U owadów holometabolicznych lizozym współdziała z cekropinami i atacynami w likwidacji zakażeń bakteryjnych. Ze względu na fakt, że poziom lizozymu jest pewnym odzwierciedleniem stanu odporności humoralnej owadów, określanie jego aktywności jest wykorzystywane w ocenie stanu odporności.

16. Określanie aktywności lizozymu metodą biologiczną • Próbki hemolimfy (5 ug) dodaje się do 25 ug płynu fizjologicznego zawiera­jącego kryształek fenylotiomocznika, a następnie wkrapla się do baseników wyciętych w żelu agarozowym w ilości 7,5 ug.

17. Określanie aktywności lizozymu metodą biologiczną • Żel sporządza się dodając do 9 ml buforu Sorensena (0,062 M, pH 6,4) zawiesinę o składzie: 1 ml buforu Sorensena, 75 mg zliofilizowanych komórek Mi-crococcus lysodeikticus i 300 mg oxytetracykliny, dokładnie roztartą.

18. Określanie aktywności lizozymu metodą biologiczną • Następnie do tak uzyskanego roztworu, po ogrzaniu dodaje się 0,1 g agarozy i wylewa na płytki (grubość żelu 2,5—3,0 mm). Po zestaleniu żelu wycina się baseniki o pojemności 7,5 µg. Płytki z wypełnionymi basenikami inkubuje się w 28°C przez 24 godziny.

19. Określanie aktywności lizozymu metodą biologiczną • Aktywność lizozymu ocenia się z krzywej regresji na podstawie wielkości strefy przejaśnienia (bakteriolizy) mnożąc uzyskane wyniki przez 6 (współczynnik rozcieńczenia hemolimfy).

20. Określanie aktywności lizozymu metodą biologiczną • Krzywą regresji sporządza się dla następujących stężeń lizozymu: 15,62; 7,81; 3,9; 1,8; 0,9; 0,45; 0,22 (yg lizozymu białka jaja kurzego/ /mililitr), odcinając na osi x stężenie lizozymu w µg/ml zaś na osi y średnią strefy bakteriolizy w milimetrach.

21. Hemolimfa Złożona z osocza i hemocytów nie bierze udziału w wymianie gazowej: • Rezerwuar wody • Środek transportu dla składników pokarmowych i produktów przemiany materii • Hormonu i enzymy • Działa buforująco • Warunkuje turgor ciała, • procesy krzepnięcia krwi i reparacji ran • Odtoksycznia wiele związków biologicznie czynnych

22. Hemolimfa • Jest środowiskiem dla hemocytów, polipeptydów i białek odpowiedzialnych za odporność komórkową i humoralną

23. Hemolimfa • Stanowi od 25 do 30 % masy ciała, np.. 116 µl u poczwarki robotnic z brązowymi oczami i 160 ml u poczwarki trutnia, 30 – 40 µl u świeżo wygryzionych pszczół, 19 u pszczół ulowych i 16 µl u zbieraczek. • Ciężar właściwy: Robotnica 1,038 – 1,045 Truteń 1,050 Matka 1,051

24. Hemolimfa Odczyn zbliżony do obojętnego : Czerw – 6,77 do 6,93 Imago – 6,7 Zdolność buforująca bardzo niska nieznacznie przekracza zdolność buforyjącą wody

25. Hemolimfa Zmienny skład w zależności od: • Wieku, • Grupy osobniczej (kasty) • Płci • Stadium rozwojego • Diety • Głodzenia

26. Hemolimfa Zdrowie choroba Profil białek hemolimfy THC DHC Egzoproteinazy bakteryjne Egzoproteinazy pasożytnicze Leki

27. Hemolimfa - pobieranie • Czerw (larwy)– ostrożnie wyjąć z komórki plastra, położyć na szkiełko podstawowe, naciąć naskórek (np. b. cienka igła) i pobierać mikropipetą • Przedpoczwarki, poczwarki i dorosłe – dekapitacja i lekkie uciśnięcie tułowia • Poczwarki i imago – zatoka grzbietowa, między 3 a 4 tergitem odwłoka po stronie grzbietowej

28. Hemolimfa - rozmaz • Po pobraniu do kapilary przenosi się na szkiełko podstawowe • Rozmaz krawędzią nakrywkowego • Schnie w temperaturze pokojowej • Szkiełka odtłuszczane w mieszaninie 96% etanolu i eteru do narkozy (1:1)

29. Hemolimfa - barwienie • Wyschnięty preparat zalewa się 2-3 ml barwnika Wrighta na 1 minutę • Dodaje się identyczną objętość buforu fosforanowego (KH2PO4 – 3, 315 g, Na HPO – 1,28 g, woda destylowana – 500,00 ml, miesza się do pojawienia się metalicznego połysku na powierzchni barwnika z buforem • Po 2-3 minutach od dodania buforu powierzchnię preparatu zmywa się szybko wodą bieżącą • Uwaga! Nadmierne zmywanie odbarwia preparat • Wysuszyć i oglądać pod imersją przy pow. co najmniej 700 x.

30. Hemocyty • Wywodzą się z mezodermy zarodka • Równowaga pomiędzy pojawianiem się nowych i zamieraniem starych • Równowaga pomiędzy hemocytami krążącymi a osiadłymi senssile haemocytes)

31. Hemocyty • Wywodzą się z komórki pnia (stem cell) prohemocytu (podstawowa komórka hemolimfy) • Prohemocyty skupione wzdłuż przedniego odcinka grzbietowego naczynia krwionośnego wykształcają plazmatocyty i (?) komórki sferyczne • Rozplem i diferencjacja hemocytów w hemolimfie głównie przez podziały mitotyczne związane z rozowojem osobniczym, tuż przed kolejną zmianą stadium wzrosta THC (obserwowane również u imago)

32. Hemocyty Układ endokrynalny owada (głównie ekdyson) Wzajemne stosunki pomiędzy typami hemocytów Wielkość indeksu mitotycznego Przechodzenie z narządów hemopoetycznych do hemolimfy Mobilizacja komórek osiadłych

33. Hemocyty – Ciało tłuszczowe • Pochodzenia mezodermalnego • Wielkość zmienna wraz z rozwojem larwalnym – najwięcej komórek u larw 2 – 3 dniowych • U pszczoły dorosłej jest cienką warstewka wyściełającą od wewnątrz ścianę odwłoka(zatoka krwionośna grzbietowa i brzuszna)

34. Hemocyty – Ciało tłuszczowe prohemocyt plazmatocyt Komórka sferyczna Komorka ziarnista cystosyt

35. Hemocyty - identyfikacja Klasyfikacje: • Jonesa (1962) – 9 typów hemocytów • Ville i Vecchi (1966) - 8 typów • Gilliam i Shimanuki (1971) – 7 typów obecnych w hemolimfie i 2 typy komórek pnia – enocyty i komórki perikardialne

36. PROLEUKOCYT3,4 - 6,0 µ Jądro: jasnoniebieskie Cytoplazma: niebieska

37. Neutrofil3,0 – 7,0 µ Jadro: ciemnoniebieskie ziarniste Cytoplazma: niewidoczna

38. Eozynofil 3,0 – 6,0 µ Jądro: ciemnoczerwone ziarniste Cytoplazma: jasnoróżowa

39. Bazofil 2,0 – 4,5 µ Jądro: ciemnopurpurowa Cytoplazma: praktycznie niewidoczna

40. Leukocyt normalny 3,0 – 7,0 µ Jądro: ciemnoczerwone ziarniste Cytoplazma: niebieska

41. Pyknoleukocyt12-18 x 2,5- 7,5 µ Jądro: ciemnoczerwone ziarniste Cytoplazma: lekko różowa

42. Hialinocyt7 – 11 x 3,5 – 7,0 µ Jądro: ciemnoczerwone ziarniste Cytoplazma: lekko różowa

43. Reakcje między komórkami immunoreaktywnymi Owady – hemokiny przekaźnikami informacji między immunocytami • TNF (czynnik martwicy nowotworów – reguluje niekóre odczyny immunologiczne • TNF wspólnie z gallizyną 2 kontroluje utrzymanie integralności ciała owada (wzrost, zranienia) • Gallizyna 2 wraz z plazmatocytami współdziała: • w fagocytowaniu uszkodzonych komórek ciała • w gojeniu ran i tworzeniu nowych tkanek

44. Model aktywności hemokin owada zakażenie • Aktywność • Lizozymu • Układu oksydazy polifenolowej • Odczyny komórkowe • Adherencja • 2.Fagocytoza • Nodulacja hemocyty Aktywowane hemocyty Regulacja Kontrola nowotworzenia Przebudowa tkanek Uszkadzanie komórek HEMOKINY Ciało tłuszczowe Po;ipeptydy i białka bakteriobójcze

45. Rola hemocyta ziarnistego owada Apidycyny bakteriocydia Lizozym - bakteriocydia Fagocytoza Nodulacja i inkapsulacja Koagulogeny Krzepnięcie hemolimfy Profenylooksydaza rozpoznawanie Lektyny rozpoznawanie

46. Fagocytoza • Fagocytoza jest to proces, polegający na pochłanianiu, niszczeniu lub sekwestracji substancji obcych dla: organizmu owada, które przedostały się do jego hemocelu. U owadów przebiega ona w kilku etapach: chemotaksja, adherencja, pochłanianie i trawienie.

47. Fagocytoza • Stanowi ona jeden z głównych mechanizmów komórkowego ramienia odporności owadów, w którym zaangażowane są wyspecjalizowane komórki krwi owadów.

48. Fagocytoza-Typy hemocytów zaangażowane w reakcjach odpornościowych

49. Fagocytoza • Fagocytoza ulega zwiększeniu w początkowych fazach zakażenia, wybitnie spada w niektórych inwazjach pasożytniczych, np. w przebiegu warozy. • Wgląd w aktywność fagocytarną hemocytów daje indeks fagocytarny, który wskazuje na średnią liczbę bakterii pochłoniętych przez 1 hemocyt obdarzony zdolnością fagocytarną. Określanie wartości indeksu fagocytarnego wykorzystuje się powszechnie w ocenie efektywności komórkowego ramienia odporności owadów.

50. Fagocytoza Najstarszy filogenetycznie mechanizm obronny reprezentowany przez wyspecjalizowane komórki krwi i niektóre komórki osiadłe - fagocyty • wychwytywanie • niszczenie obcych materiałów