Preimplantační genetická diagnostika

1. Preimplantační genetická diagnostika Oddělení lékařské genetiky FN Brno Gynekologicko - porodnická klinika Masarykovy univerzity v Brně

2. PGD • alternativa k prenatální diagnostice • alternativní prevence potratů indikovaných po amniocentéze • preventivní a cílená diagnostika dané geneticky dědičné nemoci • selekce embryí pro IVF u párů s rizikem transmitující genetické choroby

3. Co předchází provedení PGD ? • Genetické poradenství před cyklem IVF - konzultace s párem včetně genetického vyšetření • Poradenství s gynekologem a embryologem • Informovaný souhlas pacientky

4. Genetická analýza • oocyt/zygota (polární tělísko) • blastomera (embryo) • blastocysta

5. Biopsie polárního tělíska (PB biopsie) • původně preferováno z etických důvodů(manipulace s oocyty , genetický materiál použitý k analýze není částí vyvíjejíciho se embrya) • komplikace:možnost rekombinace genotyp paternální alely zůstává neznámý • možnosti PB analýzy : detekce numerických chromozomálních abnormalit maternálního původu • “age related” aneuploidie • žena nositelka translokace • většina center PGD toto vyšetření nepreferuje

6. Biopsie blastocyst • blastocysta: • opouzdřená struktura obsahující přibližně 100 buněk • vyvíjí se 5-6 den po inseminaci • trofoektodermální buňky - odvozeny z placenty a jiných extra-embryonálních tkání • odběr 10 buněk nepostihuje časný vývoj embryí, ale neví se jaký efekt ná na pozdější vývoj fetu • pouze asi 40-50% preimplantovaných embryí se vyvine do tohoto stádia in vitro • výhoda: • menší technická náročnost biopsie • možnost více buněk k analýze

7. Biopsie blastomer • 3.den fertilizované embryo: 6-8 totipotentních buněk • hlavní nevýhoda: • limitované množství materiálu, doporučována biopsie a analýza dvou blastomer z každého embrya • většina center PGD preferuje biopsii blastomer

8. Princip biopsie blastomer • Odběr blastomery z rýhujícího se embrya • Testování blastomery metodami molekulární biologie • Eliminace embryí se specifikovanou genetickou vadou

9. Technika provedení biopsie blastomer • Fertilizace metodou ICSI • Biopsie po 72 hod. kultivace • Narušení zona pellucida • Odběr blastomer v EB mediu • Fixace blastomery na podložní sklo • Kultivace embryí po biopsii (48 hod.) • Oplach a transport blastomer v dest. vodě pro PCR vyšetření

15. Smějící se blastomera

17. Diagnostika PGD • chromozomální abnormality: • aneuploidie chromozomů X,Y, 13, 18, 21 • určení pohlaví • FISH metoda • nevýhoda: častý výskyt chromosomálního mozaicismu • monogenní choroby • pro jakoukoli genetickou chorobu u které je dostatečná sekvenční informace • PCR • fenomén: allelic drop out (ADO)

18. PGD chromozomálních abnormalit • chromozomy v interfázním jádře buňky • první PGD : FISH na X-vázané choroby (stanovení pohlaví) • většina chromozomálních abnormalit je maternálního původu - častá aplikace biopsie pólového tělíska (PB) • limitace: • starší ženy nebo ženy s opakovaným IVF: limitovaný počet kvalitních embryí/oocytů (aneuplodie!) • maximální počet chromozomů analyzovaných z jedné buňky je 7 - 9 • chybné stanovení aneuploidie dosahuje až 15%, nejčastější příčinou chyb: • „background“ fluorescence, slabý signál, ztráta jádra při aplikaci blastomery na podložní sklíčko • nyní zavádění CGH v PGD

22. PGD monogenních chorob • genotypování jedné buňky založeno na metodě PCR • komplikace : • možná kontaminace vzorku • cumulus buňky, obklopující oocyt/maternální původ kontaminace • spermie, zapuštěná do zony pelucidy pro fertilizaci/paternální kontaminace • ADO (alelic drop out) - amplifikace jedné alely pod úrovní detekovatelnosti • optimalizace PCR (výskyt ADO <10%) • příčina ADO: obecně neznámá, avšak je ovlivněna : • metodou buněčné lyse před PCR • PCR podmínkami • sekvencí cílové DNA • velikostí PCR produktu

23. Minimalizace ADO • protokol monitorující výskyt ADO: • multiplex PCR (dva a více lokusů vztažených ke genotypu) • SSCP nebo DGGE analýzy ( detekující obě alely současně, potvrdí genotyp) • fluorescenční PCR - redukuje výskyt ADO, detekce DNA fragmentu je až 1000x citlivější ve srovnání s konvenční PCR technikou

24. Nevýhody PGD • Limitovaný počet buněk dostupných genetické analýze • Možné riziko narušení vývoje vyšetřovaného embrya • Není vyloučená jiná genetická vada • Doplnění PGD amniocentézou

25. Výsledky provedené PGDčerven 2001 – srpen 2002

26. Výsledky PGD v období červen 2001 – srpen 2002

27. PGD u Cystické fibrózy • CF představuje nejčastější žádost o PGD • incidence 1/2500 novorozenců • minoritní forma CF je způsobena kongenitální bilaterální absencí vas deferens (CBAVD) • CBAVD nepostihuje spermatogenezi IVF + intracytoplasmická injekce testikulárních spermií (ICSI) • jestliže partnerka je také nositelkou některé z mutací CFTR genu, pak ICSI procedura je následována PGD • 70% mutací CFTR genu v Evropské populaci : dF508 • oba partneři nositelé dF508 (49%) • jeden partner :dF508 a druhý jiná mutace (42%) (PGD zaměřena na eliminaci embryí nesoucích dF508 • oba partneři nesou jinou mutaci než dF508 (9%) (specifický test na detekci mutací nebo nepřímá DNA dignostika)

28. Identifikace alel • nepřímá DNA diagnostika: užití polymorfních míst v genu (haplotyp) • jednoduchý a universální test pro všechny páry, jakmile je nalezena heterozygozyta polymorfního místa • interní kontrola kontaminace vzorku • dva a více polymorfních markerů snižuje riziko chybné interpretace (ADO) • vyhodnotí status ploidie testované blastomery

29. Fragmentační analýza dF508 z jedné buňky

30. Molekulární biologie nádorů patogeneze nádoru: „multi-step“ proces postupná akumulace genetických defektů • mutace tumor supresorových genů a onkogenů výhoda růstu a přežití • nezávislost buňky na růstových faktorech a anti-growth signálech • zvětšující se nádor utlačuje okolní tkáně: akumulace dalších mutací vznik vlastního krevního zásobení • ztráta kontaktu se sousedními buňkami • změny související s down-regulací exprese buněčných markerů (MHC+TAA) • proces metastáz : degradace extracelulární matrix, buněčnou migraci, tvorbu nových lymfatických cest a expresi receptorů pro chemikiny „homing ve specifických tkáních

31. Genová terapie nádorů • Vývoj choroby odolávající léčbě • výsledek overexprese určitých genů, které redukují akumulaci cytotoxické chemoterapie • nebo výsledek zvýšené schopnosti buňky k opravě DNA poškození • Výzkum : identifikovat další geny , které jsou zahrnuty do vývoje, progrese, šíření a rezistence k léčbě nádoru • Každá z těchto abnormalit, odlišujících nádorovou buňku od normální representuje možný cíl genové terapie

32. Strategie „cancer gene therapy“ (CGT) • korektivní genová terapie: • obnoví normální funkci deletovaného nebo mutovaného genu (obvykle tumor suppressor gene) • ruší efekt mutovaného onkogenu • cytoreduktivní genová terapie • vloží exogenní gen , který navodí buněčnou smrt buď: • toxickou látkou (produkt metabolismu) suicide gene therapy • indukcí apoptózy • anti-angiogenní aktivitou • posílením účinků lokální radioterapie • imunomodulátorová genová terapie • vložený gen zvýší schopnost imunitního systému k efektivní cytotoxické odpovědi

33. Korektivní genová terapie • obnova normální funkce tumor suppressor genů • geny, kontrolující buněčný cyklus • suprese funkce onkogenů • antisense oligonukleotidy • katalytické ribozymy

34. Obnova funkce tumor suppressorových genů • p53 • jaderný fosfoprotein • centrální role v mnoha procesech, které chrání buňku proti genotoxickému stresu • DNA poškození p53protein zprostředkuje G1/S buněčný „arrest“ (DNA reparace) • poškození přesahuje kapacitu DNA opravy apoptóza • exprese v mnoha nádorových tkáních • plíce, tkáň prsu, kolorektal, prostata, pankreas, vaječník • mutantní p53: špatná prognóza • dodání p53 genu do nádorových buněk prokázalo zvýšenou citlivost nádorových buněk k účinku radioterapie a chermoterapie

35. Geny, kontrolující buněčný cyklus • buněčný cyklus normálních buněk je velmi přísně kontrolován • G1,S,G2,M • přechod G1 do S fáze : „checkpoint“ • nádorové buňky: kontrola G1/S „checkpointu narušena • proces je regulován 3 tumor suppressor genovými rodinami: Rb, Cip/Kip (p21,p27) a Ink4 (p16 a p14) • mutace v cdki a aberantní exprese Rb vede k nekontrolovatelnému růstu nádorových buněk

36. Suprese funkce onkogenů • nejčastěji mutované onkogeny v nádorových buňkách: ras, myc, erbB2 a bcl-2 • strategie CGT: negovat aktivitu mutovaných genů zaměřením na: transkripční/translační mechanismus • interferovat s transkripcí (antisense oligonukleotidy) • zabránit mRNA v translaci (AO,katalytické ribozymy)

37. Cytoreduktivní genová terapie • cílem je vpravit geny, které navodí buněčnou smrt • přímo : zvýší citlivost k účinkům léků nebo radiace • nepřímo: deprivace zásobení krví v nád. buňce • gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT) • genetická indukce apoptózy • anti-angiogenní genová terapie • genetická radioizotopová terapie

38. Gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT) • vpravení genu , kódujícího enzym, který je schopen selektivně v nádorových buňkách konvertovat relativně neškodnou látku na toxicky aktivní • zabrání systémové toxicitě a zajistí tvorbu cytotoxického agens ve vysokých koncentracích pouze v nádorových buňkách

39. Imunomodulační genová terapie • intratumoural delivery MHC, cytokine gene • liposomy • rekombinantní vakcíny • retrovirové a adenovirové vektory • nádorové vakcíny s geneticky modifikovanými buňkami : nádorové + normální buňky • od jednoho pacienta (autologní přenos) • od jiného pacienta ( allogenní přenos) • jiného druhu (xenogenní přenos)

40. Imunomodulační genová terapie • mnoho nádorů projevuje na svém povrchu tumor -associetad antigens (TAA) • rozpoznávány imunitním systémem • mnoho nádorů dokáže obejít imunitní odpověd, buď: • redukcí vlastní imunogenicity • inhibicí účinné odpovědi imunního systému • Výhody: • specifická imunitní odpověď • malý imunogenní signál stimuluje kapacitu imunitní odpovědi ke spuštění velké odpovědi • anti-tumor imunita přetrvává v v generacích paměťových buněk prevence opětovného nástupu choroby

41. Princip imunomodulační GT • aktivovat specifické CD8+CTL, které rozpoznávají TAA na povrchu nádorových buněk a zabíjí je.