Università degli studi di Pavia

1. Università degli studi di Pavia MESSA A PUNTO DELL’APPARATO OTTICO DI UN SISTEMA COMPATTO PER MICROSCOPIA OTTICA A DUE FOTONIElaborato di Laurea di ELENA UGOLOTTIRelatore: Prof. A. TomaselliCorrelatore: Prof C. Vacchi

2. Scopo del progetto Sviluppare un sistema: • Che sfrutti la microscopia a due fotoni • Possibilità di osservare campioni biologici in vivo • Risoluzioni submicrometriche • Economico • Compatto

3. Microscopia a due fotoni Due fotoni simultanei nell’IR stimolano lo stesso salto energetico di un singolo fotone nell’UV-VIS Vantaggi: • Processo non lineare: L’intensità è concentrata solo nel punto da osservare • Non si generano radicali liberi • Maggior penetrazione nel campione

4. Schema del microscopio presente in laboratorio: Specchi di deflessione f=35mm f=85mm Divisore di fascio Obiettivo f=30mm Campione Laser Fototubo

5. Microscopio presente in laboratorio

6. Scopo del mio lavoro: Quando ho iniziato il lavoro, lo schema del microscopio era provvisorio in quanto non era mai stato fatto uno studio accurato e delle simulazioni del sistema ottico. Scopo del mio lavoro: studiare la configurazione ottica ottimale per il sistema, che sia un buon compromesso tra compattezza del dispositivo e risoluzione ottenibile.

7. Fasci gaussiani Parametri importanti: Distanza di Rayleigh: Raggio di curvatura: Raggio di curvatura complesso q(z): Raggio del fascio:

8. Metodo matriciale “ABCD” La propagazione dei fasci Gaussiani attraverso ottiche anche complesse può essere studiata tramite le matrici ABCD: Se ci sono più elementi ottici in cascata la matrice totale del sistema è il prodotto delle matrici dei singoli elementi. Con le matrici ABCD si ricava direttamente:

9. Analisi del sistema: Con il laser He-Ne si ha: • λ = 632 nm • w0 = 0,4 mm f1 = 35 mm, f2 = 85 mm θg = 0,08 rad zr = 79 cm wc = 1 μm La zona di campione investigata è un quadrato di lato 340 μm La risoluzione che si ottiene non è sufficiente. Bisogna modificare le distanze tra le ottiche o le focali delle lenti per migliorarla senza diminuire l’area investigata.

10. Miglioramento della risoluzione La risoluzione migliora quanto più le dimensioni del fascio sul campione sono piccole Il fascio deve incidere più ampio possibile sull’obiettivo

11. Variabili che ho provato a modificare nel sistema: dS-L1 dL1-L2 dL2-O f1 f2

12. Distanza specchi-prima lente: Influisce sull’allontanamento del fascio dal centro Bisogna assicurare l’ingresso di tutto il fascio nell’obiettivo e l’ingresso sulle lenti in zone centrali non soggette a non idealità Soluzione migliore: Distanza pari alla focale della prima lente Determina le dimensioni di campione esplorato durante la scansione

13. Focale della prima e della seconda lente del telescopio: • Entrambe le lenti del telescopio devono essere convergenti • Ingrandimento M=f2/f1 f1 piccola, f2 grande • Per le considerazioni fatte prima sulla distanza specchi-prima lente e sugli ingombri, f1 non può essere troppo piccola f1 = 35 mm ; f2 = 85 mm

14. Distanza tra le lenti: • Telescopio con lenti convergenti d = f1 + f2 • Se d < f1 + f2 fascio uscente divergente • Se d > f1 + f2 fascio uscente convergente La convergenza non conviene: - si perde ingrandimento - si peggiora compattezza microscopio La divergenza può essere vantaggiosa: - a pari compattezza aumenta l’ingrandimento - peggiorano le dimensioni totali investigate Per operare in divergenza: f2 = 150 mm

15. Distanza telescopio - obiettivo: • Indifferente se si opera in collimazione Più piccola possibile per ridurre ingombro totale del microscopio • Se si opera in divergenza: distanza grande migliore risoluzione, ingrandimento maggiore, zona esplorata più piccola

16. IDEA: Doppio telescopio Ho pensato di aggiungere un secondo telescopio prima degli specchi di deflessione per ingrandire ulteriormente il fascio • Significativo miglioramento della risoluzione • Aumento delle dimensioni del microscopio • Perdita di potenza sulle lenti

17. Schema finale del microscopio: Lente f=85-150mm Lente, f=30mm Galvospecchi Lente f=35mm Lente f=75mm Lente f=40mm Obiettivo 40x Campione Fototubo specchio Beam-splitter

18. Immagini di un campione graduato prima delle modifiche 50 μm Ingrandimento 1x Ingrandimento 4x

19. Immagini del campione graduato ottenute con il doppio telescopio e in collimazione (f2=85mm): 50 μm Ingrandimento 1x Ingrandimento 4x

20. Immagini del campione graduato ottenute con il doppio telescopio e in divergenza (f2=150mm): Ingrandimento 1x Ingrandimento 4x

21. Immagini di circuiti microelettronici (1):

22. Immagini di circuiti microelettronici (2): 2 μm

23. Immagini dei globuli rossi: 7 μm Ingrandimenti 1x e 4x; diametro globuli di circa 7 μm

24. Immagini sferette di diametro 2,5 μm: In collimazione (f2=85mm) In divergenza (f2=150mm)

25. Caratterizzazione della profondità di fori su silicio per BrightSolutions: 8 campioni di silicio con fori per aumentare la superficie illuminata di celle solari Campioni diversi hanno fori di profondità diversa perché eseguiti con laser a potenza diversa Misurare la profondità dei fori contando quanti passi intercorrono tra il punto in cui è a fuoco la superficie o il fondo del foro

26. Futuri miglioramenti previsti (1): Meccanica: • Visualizzare un campione posto in orizzontale • Creare un supporto fisso definitivo Software: • Sviluppare un software per poter ricostruire immagini in 3D

27. Futuri miglioramenti previsti (2): • Replicare una sorgente impulsata per il microscopio Possibili sorgenti: • Cr: Forsteriteλe=1240; λp=1064; Δimp=20-100fs frip=60-150MHz • Cr: LISAF λe=860; λp=670; Δimp=20-100fs frip=80-150MHz • Nd: Glass λe=1054; λp=804; Δimp=300fs frip=140MHz • Sostituire il Beam-Splitter con un ColdMirror

28. GRAZIE PER L’ATTENZIONE