1 / 62

Immunofænotypning af malign hæmatologisk sygdom: WHO

Immunofænotypning af malign hæmatologisk sygdom: WHO. Diagnostik af hæmatologiske sygdomme følger så vidt muligt: WHO-klassifikationen: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW (Eds) IARC Press, Washington 2008 Findes i laboratoriet og konf.rum. Flowcytometri antistoffet.

presta
Download Presentation

Immunofænotypning af malign hæmatologisk sygdom: WHO

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Immunofænotypning af malign hæmatologisk sygdom: WHO Diagnostik af hæmatologiske sygdomme følger så vidt muligt: WHO-klassifikationen: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW (Eds) IARC Press, Washington 2008 Findes i laboratoriet og konf.rum. Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  2. Flowcytometriantistoffet Antigen-bindende del Antigenet = Markøren som cellen undersøges for, påvises ved hjælp af fluore- scens fra det konjugerede Fluorokrom Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  3. Flowcytometri - princip celle Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  4. Markørpanelet består af monoklonale antistoffer rettet mod et udvalgt panel af linje- og differentieringsmarkører. Fluorescens fra et eller flere fluorokrom-konjugerede antistoffer med specifik affinitet til antigener på celleoverfladen eller inde i cellen kan give oplysninger om cellens linjetilhørsforhold og differentieringsgrad. Monoklonale antistoffer Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  5. Dual laser flow- cytometre kan ex- citere fluorokromer med 2 bølgelængder og opnå (mindst) 4-farve-fluorescens. Moderne flowcytometre har flere lasere og kan derved opnå mindst 10 parametre. FLOWCYTOMETRETS OPBYGNING (FACSCalibur) Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  6. Flowcytometri: princip Et flow cytometer kombinerer: et væske-flow system der transporterer cellerne forbi en eller flere lasere et optisk/elektronisk system til detektion af (laser) lys-spredning og fluorescens Et software som analyserer data og visualiserer dem Fluorescens: bestråling af fluorokromet med lys af én bølgelængde fører til emission af lys af en anden (højere) bølgelængde Lysspredning: Spredning af laserlyset giver oplysning om cellens størrelse og kompleksitet (granula mm.) Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  7. FL1:530 FL2: 585 Fluorokromer: Excitations- og emissionsspektra FL4:695 FL3:670 Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  8. FSC ~ størrelse LYSSPREDNING SSC ~ Granulering Laserlys Spredningen af laserlyset giver oplysning om cellens størrelse og kompleksitet incl. granula i cytoplasmaet. (NB: Dette er ikke fluorescens) Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  9. LYSSPREDNING Ved hjælp af lysspredningen kan cellerne i prøven differential-tælles i hhv. lymfocytter og monocytter = mononucleære celler (MNC) samt granulocytter : Normal knoglemarv (Winthrobe tabel 2.6) Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  10. Dot plots,Lysspredning og fluorescens Flowcytometri data afbildes ofte som dot plots hvor hver enkelt celle er en prik i et koordinatsystem, og kan optræde som populationer (minimum 50 events) Med lysspredningen kan man vurdere forholdet mellem de forskellige populationer og indkredse (gate) en population Med fluorescens kan man undersøge den gatede populations linje-tilhørsforhold og differentieringsgrad Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  11. CD45 og opmodning BLAST AREA MATURE CELLS CD45 B-LYMPHOID NEUTROPHIL MONOCYTOID ERYTHROID CD45 CD45 Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012 CD45

  12. Forward/side scatter vs SSC/CD45-gating Forward/side-scatter Side-scatter/CD45 Lymfocytter Monocytter Neutrofile Blastvindue Plasmaceller MNC Neutrofile Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  13. CD45-gating-eksempel: CD56+,CD7+ AML Nuværende princip: Blastvindue defineres. Med CD45-APC i alle glas kan en population identificeres med een farve og spores (backtrackes) i dot plots for de 3 andre antigen-kombinationer, idet det antages at alle glas er ’ens’. Nyt princip: alle markører undersøges i et glas. Analysen styrkes af sammenligning med raske personer samt den matematiske analyse som antager at de celler der ligger lige ved siden af hinanden er ens. Blastvinduet Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  14. Flowcytometri med Euroflow/Infinicyt • B-celle analyse med reference-images (MRD). • Flere markører i samme glas • Mere sofistikeret matematisk analyse • Sammenligning med referencepopulation Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  15. Linje-Ag vs differentierings-Ag Linie-antigener Linjeantigener: identificerer f.eks myeloide, T- eller B-cellelinjer Differentierings-antigener identificerer cellens modningsgrad Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  16. Linje-Ag B: CD19,20, 22, SmIg CD19 er Reference- markør T: CD3,CD2, CD7,CD5 CD4/8 CD3 er Reference- markør Lymfoid differentiering(van Dongen et al 1978) Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  17. B-Lymfoide Linje- og differentierings-antigener 1 Adapted from: Loken & Wells: Imunophenotyping, Ch. 6, 2000. SIg CD10 Alle B-celler er desuden HLA-DR+ Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  18. B-Lymfoide Linje- og differentierings-antigener 2 Adapted from: Hoffmann et al (Eds): Hematology 4th Ed. CD19 Cyto-Ig Cyto-my CD10 SIg CD10 Plasmacellen taber alle B-markører og CD45 og bliver CD38+ Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  19. B-Lymfoid differentiering Præ-B-celler har endnu ikke overflade-Ig (sIg) , menudtrykker i stedet TdT (terminal transferase) og CD34 samt CD10 som siden nedreguleres midlertidigt. SIg udtrykkes aldrig samtidigt med TdT og CD34. Modne naive B-celler udtrykker B-cellereceptor-komplekset BCR = membran-immunglobulin (SmIg) og en undergruppe desuden CD5 og CD23. Efter antigen eksposition (i germinalcenteret) transformeres B-cellen til centroblasten og herefter til den mindre CD10+ centrocyt, for ultimativt at differentiere ud til plasmaceller eller memory-celler. Plasmacellen udtrykker ikke længere SIg, men det færdige cytoplasmatiske Ig (CyIg). Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  20. B-Lymfoid differentieringSmIg: Let-kæde restriktion Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  21. B-Lymfoid differentieringSmIg: Let-kæde restriktion Modne B-celler og plasmaceller udtrykker immunglobulin på hhv. overflademembranen ( = B-cellereceptoren) og i cytoplasmaet. Efter afsluttet tung-kæde gen-rearrangement søger B-cellen dernæst først at rearrangere kappa letkæde, hvilket som regel lykkes i 2/3 af tilfældene. Lykkes det ikke, forsøger B-cellen så at rearrangere lambda letkæde. I fysiologiske B-celler er κ:λ ratio derfor ca. 2:1 Maligne (klonale) B-cellepopulationer udviser letkæderestriktion (monotypi). Der er vekslende definitioner heraf, vi anvender: Kappa letkæderestriktion: κ:λ ratio mindst 10:1 Lambda letkæderestriktion: κ:λ ratio mindst 1:5 Definitionen anvendes på både membran-bundet og cytoplasmatisk Ig. Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  22. B-Lymfoid neoplasier: Postulerede normale modparter • Burkitt’s lymfom: Moden B-celle. • Diffust storcellet B: Centroblast • Follikulært Lymfom- småcellet: Centrocytten • Follikulært Lymfom- storcellet: Centroblasten • Lymfoplasmacytic lymphoma (Waldenström): memory-B cellen (SIgM+). • Marginal-zone lymfom: den præplasmacytoide marginalzonecelle • Myelomatose: Den IgG+ eller IgA+ plasmacelle som er ved at home til knoglemarven. Præ-B ALL: Precursor B-cellen CLL og MCL: den naive B-celle. Både CLL og MCL kan dog også tage udgangspunkt i antigen-erfarne (somatisk hypermuterede B-celler). Nedenstående udgår fra antigen-erfarne B-celler: Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  23. T-lymfoid differentiering TdT Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  24. T-lymfoid differentiering Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  25. T-Lymfoid differentiering Den T-lymfoide differentiering er i princippet parallelt med den B-lymfoide opmodning fra precursor-stadier over naive, modne T-celler, til antigen-erfarne effektor celler. Det væsentligste linjeantigen i T-celler er CD3 (T-cellereceptorkomplekset). CD3 udtrykkes dog først på overflademembranen på modne T-celler. Andre T-linjeantigener er CD1, CD5, CD7, og CD2 Differentieringsantigenerne er især CD34 og TdT på precursor T-celler. CD1 udtrykkes på corticale præ-T celler sammen med CD4 og CD8. Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  26. Linje-Ag (eksempler) Myelo- Monocytær: CD13, 33 Monocytær: CD14 Erythro- cytære: GpA CD36,CD71 Megakaryo- Cytære: CD41,CD61 4.3. Myeloid differentiering(van Dongen et al 1978) Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  27. MYELOIDE LINIEANTIGENER Linjeantigenerne i det myelomonocytære system er CD13 og CD33. Monocytternes linjeantigen er desuden CD14 som dog først udrykkes sent i monocytopoiesen. Stærk ekspression af CD64 eller CD11b kan anvendes som et tidligt monocyt-linjeantigen. Erytroide forstadier er ofte CD13/33-neg, og udtrykker først sent glycophorin A. CD71 samt evt. CD36 kan være vejledende. Megakaryocytforstadier udtrykker bl.a. CD41 og CD61. Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  28. GRANULOCYTOID differentiering Myelo- Blast Promyel. Myeloc. Metamyel. PMN’s From: Loken & Wells: Imunophenotyping, Ch. 6, 2000 . Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  29. MYELOIDE DIFFERENTIERINGSANTIGENERGRANULOCYTRÆKKEN I rent myeloide celler (granulocytrækken) er differentieringsantigenerne især CD34 og HLA-DR. CD13+/33+/HLA-DR+ celler som er CD34-neg og CD14-neg kan være myeloblaster, men hvis CD11b/CD64 udtrykkes stærkt, er de monocytoide forstadier. Såvel CD34 som HLA-DR tabes ved overgang fra myeloblast til promyelocyt. Der er dog APL tilfælde som er CD34+.. Vi k Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  30. MONOCYTOID MATURATION From: Loken & Wells: Imunophenotyping, Ch. 6, 2000. Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  31. MYELOIDE DIFFERENTIERINGSANTIGENERMONOCYTRÆKKEN Monocytters linjeantigen er CD14, som dog først udtrykkes sent. Umodne (CD14-neg.) monocytoide forstadier kan påvises ved hjælp af CD11b og CD64. CD11b+, CD64+, HLA-DR+,CD13+33+, CD14-neg.- celler er sandsynligvis monocytforstadier. HLA-DR udtrykkes på alle monocyt-stadier og kan ikke anvendes som differentieringsantigen i monocytrækken. Abnorme monocytter (CMML) kan bl.a. kendes ved at de mangler HLA-DR. De kan også udtrykke aberrante markører. Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  32. ERYHROID differentiering From: Loken & Wells: Imunophenotyping, Ch. 6, 2000. Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  33. MYELOIDE DIFFERENTIERINGSANTIGENERERYTHRO- OG MEGAKARYOCYTRÆKKEN Erythroide forstadier er ofte CD13/33-neg, og udtrykker først sent glycophorinA. CD71 samt evt. CD36 kan være vejledende. Megakaryocytforstadier udtrykker CD34 og CD41/CD61 og er ofte kun svagt CD33/13+ Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  34. 5. IMMUNFÆNOTYPNING VED AML OVERLEVELSE SOM FØLGE AF CYTOGENETISK UNDERTYPE 100% Favorable: t(15;17), t(8;21), inv16 Intermediære: FLT3 mutationer 50% Ufavorable (MDS-lignende) 5 0 ÅR Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  35. IMMUNFÆNOTYPNING AF AML Kan baseres på såvel WHO som på FAB-klassifikationen. I WHO klassifikationen er AML med recurrentegenetiske abnormiteter en fremtrædende gruppe med visse gennemgående immunfænotypiske træk: AML med t(8;21) (=FABM2): Ofte co-expression af CD19 og 56 (vi specialfarver for dette) AML med inv(16): Ofte Coexpression af CD2 AML med t(15;17) (=APL=FABM3): CD13/33+,CD15+,CD9+,MPO+ samt oftest neg. for HLA-DR og CD34. AML med MLL-gen aberration: Oftest myelomonocytære, dvs. med ekspression af CD4, CD11b, CD14 og HLA-DR Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  36. Immunfænotypning af AML :FAB-relateret Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  37. Flowcytometri – nogle definitioner 1 Aberrante markører: Ekspression af antigener der ikke normalt findes på denne linje. Dvs. leukæmien kan godt krydse linjespecificitet uden at være ’bifænotypisk’! Specifikke linjeantigener: Myeloid: cyMPO T-celle: CD3 B-celle: CD19 + cyCD79a, CD10, og/eller cyCD22 Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  38. Flowcytometri – nogle definitioner 2 • Acute leukaemia of ambigous lineage, herunder • Acute undifferentiated leukaemia (AUL): ingen linje-ag. • Mixed phenotype acute leukaemia (MPAL): ag fra to eller flere linjer = tidligere kaldet bifænotypisk akut leukæmi. Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  39. Precursor B- og T-celle neoplasier (ALL) ALL Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  40. Præ-B ALL No gate G1=R1 Precursor _B- og T-neoplasierne - her vist som precursor B-ALL (CD19+,CD10+) - er blastære (ligger i blast-vinduet) og udtrykker blastære differentierings- Antigener (CD34, TdT). Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  41. Immunfænotypning af precursor B - celle neoplasier NB: CD10 kaldes også ”Calla” Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  42. Precursor B - celle neoplasier relevante undertyper mht behandling • Burkitt eller ej • B-ALL/B-PLL/B-CLL • +/- Ph+kromosom Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  43. Immunfænotypning af precursor T - celle neoplasier Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  44. 7. Immunofænotypning af moden B-lymfoproliferativ sygdom Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  45. CD19-POSITIV: B-LYMFOCYT LETKÆDE RESTRIKTION: LYMFOM CD5-POSITIV CD5-NEGATIV CD23-POSITIV CD23-NEGATIV CD10-POSITIV CD10-NEGATIV SMÅ SMÅ STORE STORE MCL CLL PLL? Richter? FL DLBCL MALTOM? SMZL? LPL? SMÅ MALIGNE B-CELLE SYGDOMME VEJLEDENDE DIAGNOSTISK HIERAKI FORKORTELSER: CLL: KRONISK LYMFATISK LEUKÆMI; PLL: PRO-LYMFOCYT LEUKÆMI; MCL: MANTLE CELLE LYMFOM; FL: FOLLIKULÆRT LYMFOM: DLBCL: DIFFUST STORCELLET B-CELLE LYMFOM MALTOM: MUCOSA ASSOCIERET LYMFOM; SMZL: SPLENISK MARGINALZONE LYMFOM: LPL: LYMFOPLASMACYTÆRT LYMFOM (WALDENSTRÖM). Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  46. KRONISK LYMATISK LEUKÆMI (CLL): Ca 250/år i Danmark Immunfænotypning af modne B-lymfoproliferative sygdomme: CLL CLL CLL Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  47. Modne B-Lymfoide neoplasier:CLL CLL kan både have udgangspunkt i naive (uden somatisk hypermutation) og i antigen-erfarne (post kimcenter = med somatisk hypermutation) – B-celler. Fænotypisk er begge undertyper CD5+ og CD23+ med svag sIg- og CD20- ekspression. Ny markør: CD200+. De umuterede udtrykker oftere CD38 og ZAP-70. Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  48. Hårcelleleukæmi (HCL):POSTULERET NORMAL MODPART HCL? Jaffe et al: ASH 2001: Unknown postgerminal-centre Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  49. Immunofænotypning af moden T-lymfoproliferativ sygdom Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

  50. Modne T-Lymfoide neoplasier: De modne T-celle sygdomme er langt sjældnere (<10%) end modne B-neoplasier. Er som hovedregel S-CD3+ med CD4 eller CD8 restriktion. NK-neoplasier er oftest CD3-neg, CD16/CD56+. Abnorme T-celler kan ofte detekteres ved tab af T-celle antigener, samtidig ekspression af CD4 og CD8, aberrante markører, mm. T-celle klonalitet kan ikke afgøres med sikkerhed med flowcytometri. Suppler med undersøgelse af T-celle receptor (TCR)-rearrangement. Hæmatologisk Markørlaboratorium, Rigshospitalet Marts 2012

More Related