ANTICUERPOS MONOCLONALES HEMOCLASIFICADORES

1. ANTICUERPOS MONOCLONALES HEMOCLASIFICADORES Lic. René A. Rivero Jiménez, MSc. INSTITUTO DE HEMATOLOGIA E INMUNOLOGIA

2. SISTEMAS DE GRUPOS SANGUÍNEOS DE MAYOR IMPORTANCIA CLÍNICA ABO RH

3. Sistema ABO 1901: Primer sistema descubierto por Karl Landsteiner Solo dos antígenos, A y B podían explicar la existencia de 4 grupos: A, B, AB, O Pero los antígenos A y B son el resultado del funcionamiento sinergístico de dos sistemas genéticos independientes: El Hh, donde el gen activo H (cromosoma 19) crea una enzima que funciona añadiendo azúcares a un substrato precursor, antes de la acción de los genes A y B (cromosama 9)

4. Sistema ABO Antígeno H Antígeno A Antígeno B Ceramida Glucosa Galactosa N-acetilglucosamina N-acetilgalactosamina Fucosa

5. Sistema ABO EritrocitosSuero GenotiposFenotiposaAnticuerposGlucosiltransferasas A1A1, A1A2, A1OA1Anti-B-3-N-acetilgalactosaminil A2A2, A2OA2Anti-Bb-3-N-acetilgalactosaminilc BB, BOBAnti-A-3-galactosil A1BA1B----3-N-acetilgalactosaminil y -3-galactosil A2B A2B ---b-3-N-acetilgalactosaminil y -3-galactosil OOOAnti-A y Anti-B---- Leyenda:aDefinido por antisueros anti-A, anti-B, y anti-A1. bAnti-A1 algunas veces presente en el suero de individuos de los grupos A2 y A2B. cN-acetilgalactosaminiltransferasas en sueros del grupo A2 difieren en las propiedades cinéticas de las enzimas en sueros del grupo A1.

6. Sistema ABO FenotipoA1 Fenotipo A2 A H

7. Sistema ABO Expresión antigénica: Forma soluble (secretores)Saliva y todos los líquidos corporales, excepto el LCR Otras células sanguíneasLinfocitos, plaquetas (adsobidos del plasma). Tejidos En casi todas la cel epiteliales (epitelio glandular) y sobre células endoteliales. Amplia distribución en tejidos (Histo- sanguíneos)

8. Sistema ABO Los heterocigotos no se distinguen de los homocigotos: A1A1, A1A2 y A1O: todos reaccionan igual con Anti-A. Frecuencia de los grupos ABO en Cuba: Grupo % A A1 27,67 A2 8,26 variantes débiles0,75 B 11,2 AB A1B 2,28 A2B 0,81 O 49,03 Becomo AA et al. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1997;13(2): 124-131. 36,68 3,09

9. Sistema ABO • Características Generales de los Anticuerpos ABO: • Alta importancia clínica. • Normalmente aparecen anticuerpos naturales en los individuos que no portan el antígeno en sus eritrocitos (evento único en la serología de los grupos sanguíneos). • Se usan de forma habitual para la determinación de los grupos sanguíneos (grupo reverso). • Son aglutininas frías usualmente clase IgM. • Activan el Complemento. • Causan hemólisis cuando son activos a 37 C (calientes).

10. Sistema ABO • Anticuerpos ABO: • Desarrollo con la edad: • En sangre de cordón umbilical Anti-A y Anti-B clase IgG de origen materno. • Se detectan en lactantes entre 3-6 meses de nacidos (clase IgM). • Mayor titulo se alcanza entre 5 y 10 años de edad.

12. Sistema Rh • Se descubrió en 1940 por Weiner y Landsteiner. • Después del ABO, el más importante en la clínica: • Anti-Rh causa reacción transfusional hemolítica • Incompatibilidad madre-hijo: enfermedad hemolítica del feto y del recien nacido. • Se han descrito hasta 52 antígenos. • Antígeno D: define condición de POSITIVO. • Otros antígenos: C,c,E,e,d. • Antígeno D: mosaico antigénico, determinado por epitopos.

13. Sistema Rh Cromosoma: 1p36.13-p34.3 Nombre de genes: RHD, RHCE Nombre del producto de los genes: polipéptido RhD, polipéptido RhCE. No. de exones: RHD 10, RHCE 10. Expresión: Eritrocitos de sangre de cordón. No formas solubles. Tejidos: Específicos de la línea eritroide.

14. Sistema Rh • El polimorfismo del RhD es único. • La mayoría de los que portan el gen D, tienen un polipéptido D completo. • Pero existen variantes débiles, por expresión disminuída o incompleta. Anticuerpos vs. Rh(D): . Los aloanticuerpos anti-Rh(D) son inmunes por su origen (no naturales). Clase IgG, usualmente IgG1 y o IgG3. Pocas veces fijan Complemento Aparecen en individuos D negativos o en D parciales

15. Producción de reactivos hemoclasificadores basados en sueros humanos policlonales: • Cada lote es una mezcla diferente de moléculas obtenidas de distintos donantes. • Cada lote se comporta de forma diferente frente a las expresiones débiles del Ag. • Hay diferente avidez. • Pueden presentar poli aglutinación frente al antígeno críptico Tn. • Se requiere obtener un policlonal anti A,B, para corroborar la reactividad del Anti-A y del Anti-B. • Se requieren técnicas manuales bien realizadas.

16. Generación de hibridomas:

17. Ventajas de los Reactivos basados en AcM: Cada reactivo monoclonal es: Una aglutinina directa. Sólo una clase de Inmunoglobulina (IgM, IgA o IgG). De sólo una especificidad epitópica. De sólo una avidez No contiene Ac contaminantes.

18. Producción de los AcM: Altamente laboriosa e intensiva en la etapa de generación de hibridomas, clonajes y caracterización de las líneas célulares. Más simple en la etapa de producción a gran escala. Cada reactivo puede ser: Un único AcM Una mezcla de AcM Generalmente, los anti-A, anti-B y anti A,B son mezclas., para que funcionen mejor en los distintos métodos de hemaglutinación.

19. Especificaciones para garantizar la calidad de los reactivos hemoclasificadores basados en AcM: • Establecer la concentración o titulo de AcM y condiciones de la solución amortiguadora (pH, conc. Salina). • Clonaje celular por 3 veces, garantía de la monoclonalidad. • Crear bancos de células semilla Maestros y de Trabajo. • Cada lote se debe generar a partir de un criotubo del hibridoma congelado. Cultivar y expandir las células mediante pases seriados por no mas de 3 meses. Después de este tiempo: desechar los cultivos.

20. Errores que se deben evitar: • AcM de alta afinidad: pueden detectar los fenómenos B(A) o A(B): cantidades muy pequeñas del antígeno contrario presentes normalmente en algunos individuos. Solución: diluir los AcM. • Algunos AcM anti-B detectan el Ag B adquirido (no el B real sino una estructura estérica muy similar, que produce alta reacción). Se adquiere por infecciones de algunas bacterias, enfermedades reumáticas, etc. Solución: formular el reactivo en pH alcalino. • Algunos AcM producen reacción en monocapa en tubos y microplacas. Solución: Tratar microplacas y tubos con Tween. Añadir albúmina o gelatina a la formulación en un bajo % (albúmina como máximo 3%, gelatina como máximo 1%). Mejor: albúmina 2-3%, gelatina 0.05%. Ayuda a la estabilidad del reactivo.

21. Problemas para la obtención del anti-D monoclonal: • Mosaico D: • Ag D es un mosaico de mas de 30 epítopos. • Cada AcM detecta un solo epítopo. • No todas las células D+ expresan todos los epítopos de D. • Du= D “normal” pero con bajo numero de sitios en eritrocitos. • Cada Anti-D monoclonal es diferente. Ningún AcM Anti-D detecta a todas las variantes, todos dejan algo. • El problema es escoger al que detecta a los mas importantes epítopos para una correcta clasificación. • Prueba de Anti-Globulina (Coombs): algunas variantes raras de D pueden dar FALSO POSITIVAS. En realidad no se deben transfundir con SANGRE Rh+, ya que D completo inmuniza.

22. Ag D no es inmunogénico para ratones BALB/c: imposible obtener monoclonales murinos anti-D. • Si se inmunizan humanos, se obtienen AcM clase IgG (poco aglutinantes): se debe seleccionar moléculas IgG3: molécula mas abierta mejor aglutinante. Producción de AcM anti-D humanos: Sangre de donantes inmunizados AcM Anti-D IgG - IgM Leucocitos + VEB Línea celular B transformada + / -fusión Clonajes

23. Reglas de Oro de la Calidad en reactivos hemoclasificadores: • Nivel seguro en el titulo de anticuerpos. • La especificidad, potencia, y avidez dependen de la concentración. • Medición de la concentración de Ac por ELISA. Ej. Uso de conjugado anti-IgM o IgG de ratón. • Garantía del pH final del producto: rango general 6.5-7.2. • Se adiciona HEPES cuando se cosechan los sobrenadantes. • Fortaleza iónica elevada, incrementa la actividad del reactivo.

24. ADITIVOS: EDTA: previene la lisis, especialmente en eritrocitos no lavados. También previene la degradación por proteolisis Gelatina: mejora la avidez, evita que los Ac formen monocapa con eritrocitos. Colorantes: Coloración intensa puede afectar resultados en microplacas.

25. Control de Calidad: Chequeo sistemático para demostrar que todo se hizo correctamente en la producción: Pruebas: Especificidad Reacción completa: 4+ Potencia: A o B 1/64 con fenotipos fuertes A1 o B Titulación con 2% de SAB 1/8-16 con fenotipos débiles: A2B o A1B para mantener la conc. de proteínas mientras se diluye. Avidez:según protocolo 5-10 segundos. Adicional: medir concentración de azida, conc. proteínas, pH y fuerza iónica.

26. Métodos de Producción: En animales de experimentación: Liquido ascítico murino (LAM). Ej. Anti-A, Anti-B. En biorreactores de fibra hueca: Todos, pero en particular el anti-D.(Mejores que los tanques agitados para la concentración de Ac). Chequear niveles de glucosa en el medio. Comenzar con SFB 5% y disminuir hasta 1% en el espacio extracapilar (las células y el SBF deben estar en el EE, mientras el medio se bombea al espacio intracapilar. La estabilidad de las líneas celulares mejora con los reclonajes. NUEVAS TECNOLOGIAS: Bibliotecas de fagos. Fragmentos de anticuerpos. Ingeniería de anticuerpos.

27. Nos vemos en Hematología Habana 2005!! Mayo 16-20, 2005 4to Congreso de la Sociedad Cubana de Hematología