ETUDE PAR CYTOMETRIE EN FLUX DU DOUBLE MARQUAGE ADN-KI67 DE TUMEURS CEREBRALES

1. ETUDE PAR CYTOMETRIE EN FLUX DU DOUBLE MARQUAGE ADN-KI67 DE TUMEURS CEREBRALES Centre Paul Papin : Laboratoire de cytométrie en flux Maîtrise de biologie cellulaire et physiologie Par Alexis Dereeper Maître de stage : Mme CHASSEVENT

2. S G1 G2 M G0 pool non prolifératif Introduction - La cytométrie en flux mesure : • Contenu en ADN ou ADN-ploïdie des cellules tumorales • % de cellules tumorales en phase S (S%) • Autre méthode d’évaluation du caractère prolifératif d’une tumeur : • quantification des cellules impliquées dans le cycle cellulaire par marquage d’une protéine spécifique des cellules en cycle : la protéine Ki67 • Double marquage ADN-Ki67 - Application aux tumeurs cérébrales

3. OBJECTIFS :1 ) Estimation de la prolifération : S% %Ki67 pos2 ) ADN-ploïdie S% % Ki67 positif Corrélations? Grade histologique de la tumeur Corrélations? Survie des patients

4. Matériels et méthodes 1 ) Patients et tumeurs - Analyse de fragments tumoraux de 54 patients. PHRC : Projet Hospitalier de Recherche Clinique • - Parmi ces 54 fragments tumoraux : • 49 conservés congelés dans l’azote liquide • 5 provenaient de coupes de tumeurs incluses en paraffine

5. 2 ) Tumeurs cérébrales et grade histologique - Proliférations de cellules tumorales dans le cerveau ou la moelle épinière • - Tumeurs gliales : 4 catégories selon le degré de malignité: • Astrocytome pilocytique : grade 1 de l’OMS • Astrocytome et oligodendrogliome : grade 2 • Astrocytome et oligodendrogliome anaplasiques : grade 3 • Glioblastome (multiforme) : grade 4

6. 3 ) La protéine Ki67 - Antigène reconnu par l’anticorps MIB1 : utilisation pour marquer spécifiquement les cellules en cycle- Contrôles de marquage : négatifs : lymphocytes quiescentspositifs : lignée cellulaire cultivée in-vitro en phase exponentielle de croissance - Protéine nucléaire exprimée par la cellule lorsqu’elle est entrée dans le cycle cellulaireMarqueur de prolifération cellulaireSon expression augmente progressivement au cours des phases S, G2 puis M du cycle.

7. S G1 G2 ADN 2n 4n G0 4 ) Cytométrie en flux - Principe • Cellules en suspension marquées par un agent intercalant de l’ADN : iodure de propidium Fluorescence rouge directement proportionnelle à la quantité de fluorochrome fixé, donc à la quantité d’ADN dans chaque cellule • L’analyse par le cytomètre aboutit à un histogramme d’ADN: • Un pic correspondant aux cellules en phase G1 ou G0 • Un pic G2-M • Un rectangle entre les 2 pics correspondant aux cellules en phase S

8. Différents types d’ADN-ploïdie : Tumeur diploïde, aneuploïde, tétraploïde, multiploïde.

9. Couplage du marquage de l’ADN à un immunomarquage indirect de l’antigène Ki67, en utilisant des anticorps MIB1 couplés au FITC. Fluorescence verte permettant d’apprécier la proportion de cellules en cycle Anticorps murin anti-Ki67 (MIB1) FITC Anticorps de chèvre anti-souris Antigène Ki67 Distinction des cellules Ki67 positives et analyse de leur cycle cellulaire

10. Résultats 1 ) Analyse d’un double marquage ADN-Ki67 Fluorescence verte % Ki67 positives = 18.1 % G2-M G1 Seuil positivité S Fluorescence rouge

11. 2 ) Comparaison des résultats du simple marquage d’ADN et du double marquage ADN-Ki67 Vérification que les données recueillies par la technique de double marquage sont les mêmes que celle de la technique de référence. Parmi les 54 fragments tumoraux étudiés, 29 ont pu être analysés en double marquage : les résultats de ploïdie et S% ne sont pas différents entre les 2 techniques.

12. 3 ) Étude des corrélations • État de prolifération : %Ki67 positif tend à augmenter avec le S% (faible corrélation : r=0.45) • Corrélation avec le grade : le pourcentage de cellules en phase S ainsi que la proportion de cellules marquées par le Ki67 augmente de façon significative avec le grade histologique de la tumeur. p = 0.003 p = 0.04

13. - Corrélations avec la ploïdie : • Le pourcentage de cellules Ki67 positives est supérieur chez les patients atteints de tumeurs aneuploïdes (p=0.01). • De même, le S% moyen est supérieur pour les patients ayant un contenu anormal en ADN. Diploïdes: S%moyen = 4.1 % Aneuploïdes: S%moyen = 9.6 %

14. Ploïdie / grade histologique : • Le % d’aneuploïdie semble augmenter avec le grade histologique de la tumeur. Test du Chi2 : p = 0.18

15. Conclusion - Mêmes résultats d’ADN-ploïdie et fraction de cellules en phase S qu’avec le simple marquage d’ADN (qualité des histogrammes d’ADN inchangée) Information supplémentaire venant renforcer la caractérisation des tumeurs - Paramètres étudiés : Ploïdie S % % Ki67 pos Corrélations avec la survie ? - Bien que S % et % Ki67pos ne soient pas en parfaite corrélation, ils évoluent de façon proportionnelle 2 techniques complémentaires dans l’estimation du caractère prolifératif de la tumeur

16. Bibliographie 1 – Coons SW, Johnson PC. (1993) Regional heterogeneity in the DNA content of human gliomas. Cancer, 72 : 3052-3060. 2 – Coons SW, Johnson PC, Pearl DK, Olafsen AG. (1994) Prognostic significance of flow cytometry deoxyribonucleic acide analysis of human oligodendrogliomas. Neurosurgery, 34 : 680-687. 3 – Du Manoir S, Guillaud P, Camus E, seigneurin D, Brugal G. (1991) Ki-67 labeling in postmitotic cells defines different Ki-67 pathways within the 2c compartment. Cytometry, 12 : 455-463. 4 – Ehemann V, Hashemi B, Lange A, Otto HF. (1999) Flow cytometric DNA analysis and chromosomal aberrations in malignant glioblastomas. Cancer Letters, 138 : 101-106. 5 – Forsyth PA, Shaw EG, Scheithauer BW, O’Fallon JR, Layton DD. (1993) Supratentorial pilocytic astrocytomas. Cancer, 72 : 1335-1342. 6 – Garcia R, Bueno A, Castanon S, Ruiz-Barnes P, Maria de Campos J, Kusak E, Fortes JR, Ortiz F, Sarasa JL. (1997) Study of the DNA content by flow cytometry and proliferation in 281 brain tumors. Oncology, 54 : 112-117. 7 – Gerdes J, Schwab U, Lemke H. (1983) Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer, 31 : 13-20.