340 likes | 592 Views
BAKTÉRIUMOK TENYÉSZTÉSE. A növekedést befolyásoló tényezők. Tápanyagok Szénforrás (CH, AS szénlánca), nitrogénforrás (pepton, ammónia) !! növekedési faktorok, vitaminok, nyomelemek Hőmérséklet pszichrofil (<20°C)– mezofil – termofil (>50 Thermus aquaticus) pH
E N D
A növekedést befolyásoló tényezők • Tápanyagok • Szénforrás (CH, AS szénlánca), nitrogénforrás (pepton, ammónia) !! • növekedési faktorok, vitaminok, nyomelemek • Hőmérséklet • pszichrofil (<20°C)– mezofil – termofil (>50 Thermus aquaticus) • pH • acidofil (Lactobacillus) – alkalofil (Vibrio cholerae), legtöbb 7,2-7,6
Oxigénigény • Obligát aerob (csak O2 jelenlétében M. tuberculosis) / fakultatív anaerob / obligát anaerob (Clostridiumok, toxikus az O2,) • CO2 atmoszféra mértéke • légköri = 0.03% • Mikroaerofil (alacsony O2, magas CO2, C. jejuni), aerotoleráns (02 jelenlétében is fermentál S.pyogenes) • Toxikus oxigénformák közömbösítésének képessége: Szuperoxid diszmutáz (2 O2- + 2 H+ H2O2 + O2) Kataláz (2 H2O2 2 H2O + O2)
Táplálkozási típusok - I • Autotróf • szervetlenből szervest építenek fel • ehhez energiaforrás: • fény (fotoautotrófok) • oxidáció (kemoautotrófok) pl. szulfid szulfát, nitrit nitrát • kórtani jelentőségük nincs
Táplálkozási típusok - II • Heterotróf • szerves tápanyagot igényelnek • C-forrás: glükóz, tejsav, keményítő, … • N-forrás: aminosavak, … • majdnem az összes patogén ide tartozik • Paratróf • csak élő sejtekben tudnak szaporodni • pl. lepra kórokozója (egértalpban), rickettsiák
Energianyerés típusai • Légzés (aerobok!) • van kataláz és szuperoxid-diszmutáz enzim • szénhidrát anyagcsere: glükóz piroszőlősav citrátkör légzési lánc sok ATP + CO2 + H2O • terminális elektron-akceptor = O2 • Fermentáció (anaerobok!) • nincs enzim a káros oxidációs termékek semlegesítésére glükóz etanol + tejsav kevés ATP + CO2 + H2
III IV II Log sejtszám I Idő Baktériumok növekedési görbéje Generációs idő 20/40 perc de M. tuberculosis 20h !! I.Lag fázis (adaptáció) II. Log fázis (exponenciális növekedés) III.Stacioner fázis (élő sejtszám változatlan) IV. Deklinációs fázis (hanyatlás, fogyás)
Táptalajok - I • Halmazállapot szerint • folyékony (húslé, buillon) • szilárd (lemez, magas, ferde agar, Koch találta ki) Petri csésze! • Előállítás szerint • természetes (epe, tej, húslé, ...) • mesterséges • Funkció szerint • „normál” • szelektív (pl antibiotikummal gátlódik ami nem érdekel minket) • differenciáló ( biokém tul alapján elkülöníthetőek a hasonló baktériumok) • dúsító STERILITÁS !!!
Táptalajok - II • Ferde és magas agar • Bouillon • Dúsítók: húsos és szérum bouillon
Véres agar Csokoládé agar Táptalajok - III Egyszerű lemez agar
Telepmorfológiai jellemzők • telep nagysága • telep fénye (tükröződő, opál, áttetsző) • telep alak(ép szélű, csipkézett, köldökös , kerek, platószerű) • telep állaga(sima, száraz, gumiszerű, elfolyós) • telep színe(pigment termelés) • hemolízis: és • tenyészet szaga (hársfa, fokhagyma)
Telepmorfológiai jellemzők • Hogy ezeket lássuk, IZOLÁLT TELEPEK-re van szükségünk:
Mintatenyészetek - I • Escherichia coli agar táptalajon • semmi különös jellemző, átlagos telepek • Klebsiella agar táptalajon • nagy poliszaccharid tok nyálkás telepek
Mintatenyészetek - II • Bacillus cereusagar táptalajon • erősen nyálkás, csipkézett szélű, felhő-szerű („medúzafő-szerű”) tenyészet, ritka az izolált telep
Mintatenyészetek - III • Proteus mirabilisagar táptalajon • rajzás !
Mintatenyészetek - IVIntracelluláris pigmenttermelés • Staphylococcus aureus • arany pigment • Staphylococcus epidermidis • fehér pigment • Serratia marcescens • vérvörös pigment
Mintatenyészetek - VExtracelluláris pigmenttermelés • Pseudomonas auruginosa • többféle pigment, extracellulárisan az egész táptalaj elszíneződik • a zöld pigment dominál táptalajon
Véres agaron Csokoládé agaron Mintatenyészetek - VI - hemolízis • -hemolízis: • Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus • teljes feltisztulás Csak véres agaron • -hemolízis: • Streptococcus pneumoniae, zöldítő streptococcusok • zöld terület a telepek körül
Anaerob tenyésztésI - Fizikai módszerek • O2 kiforralása • O2 kiszívása (vákuum – anaerosztát) • Szúrt tenyészet magas agaron (karácsonyfa)
Anaerob tenyésztésII - Kémiai módszerek 1. Redoxpotenciál csökkentése • Holman médium (apróra darált húsdarabkák) • tioglikolátos médium • indikátor jelzi az átlevegősödést • lezárás paraffin gyűrűvel
Anaerob tenyésztésII - Kémiai módszerek 2. Preis módszer • erősen O2-igényes reakció játszódik le a tenyésztési térben • GasPak: a tenyészetek behelyezése után a felszakított zacskókban levő reagensek reagálni tudnak egymással, elvonva az oxigént (CO2 fejlesztés)
Anaerob tenyésztésIII - Biológiai módszer • Fortner eljárás • elavult!! • A két részre osztott Petri csésze egyik térfelén erősen aerob baktériumot (pl. Serratia) tenyésztünk, ami elvonja az összes oxigént
Hemokultúra - I • Vér vagy más steril minta tenyésztésére • Milyen esetben alkalmazzuk: • meningitis, endocarditis, bacteraemia, szisztémás fertőzés gyanúja, peritonitis, FUO (=ismeretlen eredetű láz), mesterséges lélegeztetés során kialakuló fertőzés, kórokozó váltás terápia alatt, implantáció utáni láz, … • Inkubációs idő:7-10 nap • de: 80-90%-ban már az első 24 óra alatt pozitív lesz!
Hemokultúra - II • Fontos szabályok • Legalább két minta kell: kül. helyekről, kül. időben ! • Frissen szúrt vénából !! • legjobb a láz kezdetén • elegendő mennyiséget kell levenni (2-30 ml) • Sterilitás!! • Antibiotikum kezelés alatt: • ab-kötő gyöngyökkel • Aerob / anaerob palackpár
Transzport médiumok - I • Transzport közeg • példa: Stuart médium • a baktériumok maximum 48 óráig túlélnek, de nem szaporodnak • 0,2%-os agar • Tárolás szobahőn! • anaerobok is túlélnek
Transzport médiumok - II • Transzport táptalajok • A baktériumok szaporodnak is benne, mire a laborba érnek • Példák: Uriline, Uricult, Gonoline, stb. • Műanyag lemez két oldalán két vagy három különböző táptalaj (szelektívek is)
Biofilm - I • Jelentősége • vízben élő mikroorganizmusok 99,9%-a biofilmként él a felszíneken • élő szervezetben: felületek kolonizációja (natív és beültetett) • Kialakulása • előkészítő réteg (slime képzés): elektrolitok (Ca2+, Mg2+), fehérjék, stb. • baktériumok letapadása, konzorcium létrehozása • biofilm leszakadása (disszemináció) planktonikus
Biofilm - II • Kimutatása • elektronmikroszkóppal • üvegcső falán, festéssel • Antibiotikum rezisztencia nagyobb • penetráció gátolt • szaporodás lassúbb • géntranszfer sokkal intenzívebb (+leszakadáskor elviszik!)
Antibiotikum rezisztencia: biofilm versus planktonikus fázis Donlan, Clin Microbiol Rev. 2002; 15(2): 167–193.
Biofilm - III • Kórképek biofilmmel: • natív szívbillentyű endocarditis (Streptococcus, S. aureus, Enterococcus , Candida, Aspergillus) • beültetett eszközök: érpálya kanülök (pl. centrális vénás, perifériás), húgyúti katéterek(Enterococcus, Gram -, Pseudomonas, Serratia, Citrobacter), műbillentyű, intrauterin eszközök, fogászati implantátumok (titánium), kontakt lencse, beültetett szemlencse, csípőprotézis, térdprotézis, … • krónikus bakteriális prostatitis • CF (cisztikus fibrózis):Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, Burkholderia, H. influenzae (alginát képzés!) • periodontitis, fog plaque