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O Papel da Genética do Parasita na Doença de Chagas

LGB. O Papel da Genética do Parasita na Doença de Chagas. Juliana Ramos Pimenta. Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG. Doença de Chagas. Distribuição.  Prevalência: 16 a 18 milhões de infectados (WHO, 1991)  Formas de transmissão:

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O Papel da Genética do Parasita na Doença de Chagas

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Presentation Transcript

  1. LGB O Papel da Genética do Parasita na Doença de Chagas Juliana Ramos Pimenta Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG

  2. Doença de Chagas Distribuição •  Prevalência: • 16 a 18 milhões de infectados (WHO, 1991) •  Formas de transmissão: •  Transmissão vetorial •  Transmissão transfusional •  Transmissão congênita •  Formas excepcionais de transmissão

  3. Doença de Chagas edema periorbital (1-2%) alta parasitemia alto parasitismo tissular sintomas leves miocardites/encefalites agudas Fase Aguda

  4. Doença de Chagas Cardio-digestiva Digestiva Cardíaca ? Indeterminada Fase Crônica nenhum sinal aparente baixa parasitemia baixo parasitismo tissular diferentes formas

  5. Trypanosoma cruzi

  6. Trypanosoma cruzi Formas do parasita Amastigota Tripomastigota Epimastigota 1.5 a 5  10 a 20  10 a 20 

  7. Cepas X Clones Isolado de um paciente CEPA (MC43) MC43- Clone1 MC43- Clone2 CEPA MC43- Clone3 MC43

  8. Trypanossoma cruzi

  9. Trypanossoma cruzi

  10. Trypanossoma cruzi Variabilidade do parasita Aspectos Biológicos Aspectos Bioquimicos Aspectos Genéticos

  11. Trypanossoma cruzi Nova nomenclatura (1999) Ciclo Silvestre Adaptado a marsupiais T. cruzi I Baixa parasitemia Pacientes assintomáticos T. cruzi Ciclo doméstico Adaptado a primatas T. cruzi II Alta parasitemia Pacientes crônicos

  12. Trypanossoma cruzi Infecções policlonais de T. cruzi Ciclo silvestre Ciclo doméstico

  13. Diferentes parasitas Diferentes formas clínicas

  14. Estudos Moleculares Caracterizar geneticamente os parasitas Correlacionar com formas clínicas da doença de Chagas

  15. Microssatélites de DNA

  16. Locos de microssatélites em T. cruzi Loco Repetição (CA) MCLE01 9 MCLE08 (CA) AA(CA) 2 12 SCLE10 (GT) (TG) SCLE11 2 10 MCLF10 (AC) 9 MCLG10 (CA) A (CA) MCLE03 2 14 MCLE05 (CA) 8 (TAT) (TAC) (AAT) AAT 20 15 8 TAC (CT) (GT) CTAT(GT) 4 2 15 TAT (TC) (GT) (AAAT) 9 4 AAAT 6

  17. Amplificação de microssatélites (PCR) alelo A alelo B alelo C AA AB AC BB BC CC

  18. Análise dos fragmentos ALF LASER

  19. B C D Perfis dos fragmentos amplificados A A - Monoclonal (homozigoto) B - Monoclonal (heterozigoto) C - Policlonal D - Policlonal

  20. Tecidos de pacientes chagásicos Análises filogenéticas Microssatélites Células únicas de T. cruzi

  21. A B C D 0  semelhança 1  diferença A D B C Análises Filogenéticas Tamanho dos alelos PCR Árvore filogenética MATRIZ

  22. Trypanossoma cruzi Árvore filogenética Rb IX Rb VI 1502 D7 GLT 600 Rb I 1523 84Ti 95/94 1931 GLT 564 200pm GLT 593 803 Ig 62 103894 Ig 539 T. cruzi I 11/94 27/94 T. cruzi II 58/94

  23. Análises filogenéticas Tecidos de pacientes chagásicos Microssatélites Células únicas de T. cruzi

  24. PCR de células únicas Fluorescence Activated Cell Sorter Separação das células únicas através do FACS Epimas tigotas de T. cruzi

  25. PCR de células únicas Microplacas de 96 wells Sequenciador automático de DNA PCR microssatélites Eletroforese Fluorescence Activated Cell Sorter Epimas tigotas de T. cruzi Separação das células únicas através do FACS

  26. PCR de células únicas DNA Colombiana Controle - DNA JG PM 1 célula 1 célula 1 célula 1 - Well contendo 1 célula 2 - Well contendo 1 célula 3 - DNA de JG 4 - DNA de Colombiana Eletroforese Sequenciador automático

  27. Análises filogenéticas Tecidos de pacientes chagásicos Microssatélites Células únicas de T. cruzi

  28. Trypanossoma cruzi REDUÇÃO POPULACIONAL Modelo Histotrópico Clonal Parasitas disponíveis para análise Infecção policlonal Manutenção de parasitas in vitro Nem todos os clones são capazes de estabelecer infecção Isolamento

  29. Full-nested PCR 5’ 3’ TATTATTATTATTATTAT DNA molde inicial 3’ 5’ ATAATAATAATAATAATA 5’ 3’ TATTATTATTATTATTAT TAT externo F 1a amplificação TAT externo R 3’ 5’ ATAATAATAATAATAATA 5’ 3’ TATTATTATTATTATTAT TAT int. F 2a amplificação TAT int. R 3’ 5’ ATAATAATAATAATAATA 5’ 3’ TATTATTATTATTATTAT Produto final 3’ 5’ ATAATAATAATAATAATA

  30. Resultado Full-nested PCR 10 fg DNA 1a amplificação 2a amplificação Full nested Loco TAT 1 célula humana - 3g DNA 1 célula de T. cruzi - 200fg DNA

  31. Infecções experimentais (50 tripomastigotas) (50 tripomastigotas) Col1.7G2 JG (50+50 tripomastigotas) Col+JG 6m 6m 6m Reto Coração Reto Coração Reto Coração

  32. Amplificação de microssatélites em tecidos de camundongos infectados

  33. Amplificação de microssatélites em tecidos de pacientes Resultados Tecidos de pacientes (1:10) DNA hum.

  34. LGB Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG “Grupo dos Cruzi” Juliana Jorge Renato Simone Prof. Andréa Macedo

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