1 / 51

Kinetika

Kinetika. Integralni oblik MM jednačine. Krive progresa reakcije (jedna konc. S više merenja). Enzim mora da bude stabilan tokom čitavog merenja Povratna reakcija mora da bude zanimarljiva Proizvod ne sme da inhibira enzim. Kompetuju ći supstrati. Specifičnost prema kompetujućim supstratima.

dwight
Download Presentation

Kinetika

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Kinetika

  2. Integralni oblik MM jednačine Krive progresa reakcije (jedna konc. S više merenja)

  3. Enzim mora da bude stabilan tokom čitavog merenja • Povratna reakcija mora da bude zanimarljiva • Proizvod ne sme da inhibira enzim

  4. Kompetujući supstrati

  5. Specifičnost prema kompetujućim supstratima

  6. Haldanova jednačina Da li ravnoteža u reverzibilnim enzimima katalizovanim reakcijama zavisi od prisustva enzima?

  7. Ravnoteža na površini enzima Ravnotežne konstante na površini enzima su drugačije od konstanti u rastvoru. Razlozi: 1. napon; 2. neproduktivno vezivanje; 3. entropijski faktor

  8. Inhibicije • Izučavanje složenih metaboličkih puteva • Izučavanje složenih multisupstratnih reakcija • Enzimske inaktivacije i zdravlje (trovanje i lekovi) • Tipovi inhibicije: • reverzibilna (kompletna i parcijalna) i • ireverzibilna (inaktivacija) • Tipovi reverzibilne inhibicije: • Kompetitivna • Antikompetitivna • Mešovita • Nekompetativna

  9. Kompetitivna inhibicija Inhibitor (I) i supstrat se vezuju za isto mesto na enzimu Jednostavni MM mehanizam Km se menja, ali ne i Vmax

  10. Linearizovani oblici MM jednačine za kompetitivnu inhibiciju

  11. Sekundarni grafik za odredjivanje Ki u slučaju kompetitivne inhibicije LB metodom

  12. Akompetitivni tip inhibicije • Inhibitor se vezuje za kompleks ES, ali ne i za slobodan enzim • Uspostavlja se ravnotežno stanje, pri čemu je kompleks ESI u ravnoteži sa ES

  13. Linearizovani oblici MM jednačine za akompetitivnu inhibiciju

  14. Sekundarni grafik za odredjivanje Ki u slučaju akompetitivne inhibicije LB metodom

  15. Mešovita inhibicija (specijalni slučaj – nekompetitivna inhibicija)

  16. Linearizovani oblici MM jednačine za mešovitu inhibiciju

  17. Sekundarni grafici za određivanje Ki i Ki’ u slučaju mešovite inhibicije LB metodom

  18. Značenje Ki • Mešovita inhibicija i efekat mešovitog inhibitora na prividni afinitet E ka supstratu

  19. Nekompetitivna inhibicija *Inhibitor utiče samo na katalitičku funkciju enzima, ali ne i na vezivanje supstrata *Važan tip inhibicije za multisupstratne enzime *Pri niskim koncentracijama S, efekat inhibitora se može zanemariti

  20. Linearizovani oblici MM jednačine za nekompetitivnu inhibiciju

  21. Sekundarni grafici za određivanje Ki i u slučaju nekompetitivne inhibicije LB metodom

  22. Efekti različitih inhibitora na parametre u MM jednačini Km app. Km aKm Km/a’ * aKm/a’ *Specijalan slučaj: a = a’, nekompetitivna inhibicija, Km se ne menja, Vmax se smanjuje za faktor a’

  23. `=

  24. Odstupanje od MM jednačine Inhibicija supstratom

  25. Neproduktivno vezivanje Km i kcat se smanjuju Km je manje od Ks Važi i za reakcione mehanizme u kojima nastaju intermedijeri!

  26. Inhibicija proizvodom • Kompetitivna inhibicija proizvodom je posledica reverzibilnosti enzimskih reakcija • Nekompetitivna inhibicija proizvodom • Mesovita inhibicija proizvodom

  27. Hemijske modifikacije proteina

  28. Ireverzibilni inhibitori specifični za aktivno mesto enzima • Brzina inaktivacije je inhibirana supstratom, ili kompetitivnim inhibitorom; • Inhibicija prati kinetiku saturacije; • Vezivanje je 1:1; • pH zavisnost inaktivacije je slična kao kod katalize.

  29. Enzimom-aktivirani ireverzibilni inhibitori • Hemijski nereaktivni u odsustvu enzima; • Aktivirani specifično ciljnim enzimom; • U aktivnoj formi reaguju brže sa enzimom nego što disociraju iz kompleksa.

  30. Mihaelova reakcija adicije • Enzimi koji sadrže piridoksal fosfat: dekarboksilaze, racemaze, aminotransferaze • Monoamin oksidaze i flavoproteini

  31. Praktični aspekti određivanja u enzimologiji • Odredjivanja enzimskih aktivnosti • Optimalni uslovi • Prisustvo supstrata • Prisustvo kofaktora • Kinetička odredjivanja • Kinetički parametri

  32. Enzimska aktivnost (IU ili U, Katal) • Specifična aktivnost (U/mg) • Koncentracija enzimske aktivnosti U/mL • Turnover number, molekulska aktivnost (1/min, 1/s) • Aktivnost katalitičkog centra (kcat)

  33. Prečišćavanje enzima -         Neophodan je odgovarajući test enzimske aktivnosti -         Odgovarajući test za odredjivanje koncentracije proteina -         Definicije: specifična aktivnost, prinos, stepen prečišćenja, broj izmena -         Dnevnik postupka izolovanja i prečišćavanja (zapremina, conc., akt.) -         Izbegavati one korake koji daju slab prinos i mali porast u čistoći Neke osnovne definicije: • Jedinica aktivnosti (1 U): Ona količina enzima neophodna za katalizu reakcije transformacije 1 mikromola supstrata po minuti pri standardnim uslovima*. • 1 Katal – 1 mol supstrata u 1 s Primer: Ako 0,1 mg/mL enzima katalizuje konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada u 1 mL ima 10 jedinica aktivnosti.Specifična aktivnost ovog rastvora će biti 100 U/mg proteina. *Standardni uslovi: oni koji odgovaraju datom enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc). Odnosno, kad god je moguće: -         Temperatura 30 oC -         pH optimum za dati sistem Enz-Sub Koncentracija substrata na 10x poluzasićenja substratom (10 Km)

  34. Vrste merenja • Kontinualne • Diskontinualne • Direktne • Indiriktne • Kuplovani testovi

  35. Praktične metode za odredjivanje kinetike i ravnoteže • Spektrofotometrija (prirodne hromofore, NADH 340 nm; veštačke hromofore na bazi pNP estara) – radni opseg instrumenta, Lambert-Ber-ov zakon • Spektrofluorimetrija (prirodne fluorofore, NADH 340 nm – 460 nm, Trp 280 nm – 335 nm; 4-metillumbeliferon) • Cirkularni dihroizam

  36. 4. Kuplovani testovi

  37. 5. Automatska titracija kiseline i baze • 6. Elektrohemijske metode • 7. Radioaktivne procedure • 8. Manometrijske metode - prati se promena parcijalnog pritiska gasa iznad rastvora • 9. Hromatografske metode

More Related